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ルシフェラーゼアッセイ選択ガイド
Thermo Scientific Pierceルシフェラーゼレポーターアッセイキットは、目的プロモーターの制御下で発現するルシフェラーゼ酵素からの発光を測定することで、プロモーター活性を調査することができます。
ルシフェラーゼ遺伝子は、その安定性、発光、スペクトル特性が多岐にわたるため、種々のルシフェラーゼを用いたシングルおよびデュアルスペクトル解析用のレポーターキットをご用意しております。このガイドは、お客様の実験に最も適したルシフェラーゼ酵素およびキットを決定するうえで、お役立ていただけることでしょう。
製品情報
イントロダクション
Thermo Scientific Pierceルシフェラーゼレポーター遺伝子は、ヒトの遺伝暗号に最適化されており、プラスミドに組み込むことで哺乳動物細胞中での発現に最適なベクターを作製することができます。ガウシア、ガウシア-Dura（ガウシアルシフェラーゼ遺伝子の突然変異体、天然型ルシフェラーゼよりも生物発光シグナルの安定性が高い）およびウミホタルルシフェラーゼタンパク質は、細胞培養液中に分泌することで、生細胞でのリポーター活性モニタリングを可能にします。これら3つの分泌型ルシフェラーゼによって放出される光シグナルは、天然型のホタルまたはウミシイタケルシフェラーゼのそれと比較して著しく高強度です。ガウシア、ガウシア-Duraおよびウミホタルルシフェラーゼタンパク質の85%以上は細胞外に分泌されますが、細胞内に残存したルシフェラーゼもライセート中で確実に検出可能なため、他の細胞内発現型ルシフェラーゼとのマルチプレックス実験を容易に行うことができます。
緑色発光ウミシイタケルシフェラーゼは、細胞内発現型のタンパク質であり、天然型のウミシイタケおよびホタルルシフェラーゼと比べて血清安定性に優れるとともにより強く発光します。緑色発光ウミシイタケレポーターアッセイの感度は、天然型ウミシイタケルシフェラーゼを用いたアッセイのそれよりも高くなります。
赤色発光ホタルルシフェラーゼは、細胞内発現型のタンパク質であり、天然型のホタルルシフェラーゼと比べて発光ピークが赤色帯域にシフトしているため、ガウシア、ウミホタルおよび緑色発光ウミシイタケルシフェラーゼとのマルチプレックス化が可能です。
シングルスペクトルレポーターアッセイキット対デュアルスペクトルレポーターアッセイキット
シングルスペクトルレポーターアッセイキット
シングルルシフェラーゼアッセイ用のThermo Scientific Pierceルシフェラーゼレポーターアッセイキットは、フラッシュフォーマットとグローフォーマットの両方をご用意しております。
フラッシュタイプアッセイ 短時間の激しい閃光により最大限の感度を得ることができます。そのため、フラッシュアッセイ試薬を使用する場合、シグナル強度を最大化してばらつきを低減するため、試薬インジェクターを備えたルミノメーターが必要になることがあります。
グロータイプアッセイ 激しくはありませんがより長く持続するシグナルにより、試薬インジェクターなしでサンプルスループット向上に対応することができます。
デュアルスペクトルレポーターアッセイキット
Thermo Scientificルシフェラーゼデュアルアッセイキットは、高感度なフラッシュタイプアッセイであり、第1ルシフェラーゼ実験レポーターと第2ルシフェラーゼレポーターの両方を検出して正規化することができ、最初のルシフェラーゼシグナルが特定の実験条件を、2番目のシグナルがトランスフェクション効率および細胞生存率を、それぞれ反映します。
以下に掲載された最初のビデオで、デュアルスペクトルルシフェラーゼレポーターアッセイが、2種類のルシフェラーゼからのスペクトル分解をワンステップで行えることが確認できます。同一アッセイ試薬への2種類の基質添加によって、2つのルシフェラーゼシグナルを同時に測定し、個々の光シグナルをフィルターを用いて分別することができます。2種類のルシフェラーゼを同一試料中で、消光ステップなしで検出可能です。
弊社では、赤色発光ホタルルシフェラーゼとマルチプレックス化された、ガウシア、ウミホタル、緑色発光ウミシイタケルシフェラーゼのデュアルスペクトルレポーターアッセイキットをご用意しております。これらのキットのうち2つには、分泌型ルシフェラーゼ（ガウシアまたはウミホタル）と細胞内発現型の赤色発光ホタルルシフェラーゼが含まれていますが、もう1つのキットに含まれるルシフェラーゼは、どちらも分泌型ではありません（ウミシイタケと赤色発光ホタル）。以下に掲載された2番目のビデオでは、分泌型ルシフェラーゼを含むデュアルスペクトルルシフェラーゼキットを用いて、経時変化レポーターアッセイを行う方法について解説しています（分泌型ルシフェラーゼは、実験上のさまざまな時点で上清中に凝集することがあるため）。
さらなるマルチプレックス化は、異なる基質を要求する複数のルシフェラーゼを同一細胞に同時導入することで可能になります。例えば、ガウシア（または緑色発光ウミシイタケ）ルシフェラーゼを含むレポータープラスミドコンストラクトと、ウミホタルおよび赤色発光ホタルルシフェラーゼを含むプラスミドを同時導入した場合、それぞれのルシフェラーゼシグナルは、別々のウェルに分注した同一試料で、対応するシングルアッセイキットを用いて検出することができます。
製品情報
ルシフェラーゼアッセイのビデオ
ルシフェラーゼの特徴およびキットタイプの一覧表
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| ルシフェラーゼ | |||||
|---|---|---|---|---|---|
| 特質 | ウミホタル ルシフェラーゼ | ガウシア ルシフェラーゼ | ガウシア-Dura ルシフェラーゼ | 緑色発光ウミシイタケ ルシフェラーゼ | 赤色発光ホタル ルシフェラーゼ |
| 基質 | ヴァルグリン | セレンテラジン | D-ルシフェリン | ||
| サンプルタイプ | 培養液 ライセート | ライセート | |||
| フラッシュアッセイでの 相対輝度† | 107（培養液） 106（ライセート） | 107 | 105 | ||
| フラッシュアッセイでの 平均半減期 | 30分 | <5分 | 非該当 | 5分 | >30分 |
| グローアッセイでの 平均半減期 | 1時間 | 非該当 | 1時間 | 3時間 | 2時間 |
| †フラッシュアッセイ試薬は、HEK293細胞（トランスフェクション後24時間経過）の培養液またはライセートを分注したサンプルウェルに添加した。すべての発光（RLU）は、Thermo Scientific Varioskanルミノメーター（積分時間＝0.1秒/読み取り）で測定した。 | |||||
Thermo Scientificルシフェラーゼの同時導入における適合性チャートリンククリックで製品グループページに移動
Thermo Scientificデュアルスペクトルルシフェラーゼレポーターアッセイキット
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For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.