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最適な cDNA 合成のための 5 ステップ
逆転写によって RNA 鋳型から DNA が合成されると、相補的 DNA（cDNA）が生じます。こうして得られた cDNA は、遺伝子発現などの RNA 研究向け各種ダウンストリームアプリケーションにおいて鋳型として役立ちます。したがって、cDNA 合成は、分子生物学プロトコルのファーストステップとみなされます。cDNA 合成を初めて行う場合や、プロトコルを最適化したいと考えている場合には、cDNA 合成効率が最大限となるように、以下の 主要な5ステップを適用してください。
ステップ 1.サンプルを調製する
RNA は cDNA 合成においてテンプレートの役目をします。トータル RNA は日常的に RT-(q)PCR などのダウンストリームアプリケーションのための cDNA 合成に使用されますが、一方で、特殊なタイプの RNA（例えば、メッセンジャー RNA（mRNA）や miRNA のようなスモール RNA など）は、cDNA ライブラリの構築や miRNA プロファイリングを行う際に、濃縮が必要となる場合があります。
RNA をインタクトに保つことが極めて重要であり、抽出、調製、保存、実験での使用においては、特別な注意が必要となります。RNA の分解を防ぐための最善策は、グローブを着用し、エアロゾルバリアチップでピペット操作を行い、ヌクレアーゼフリーの実験器具と試薬類を使用し、実験エリアを汚染除去することです。
RNA の分離精製には、材料の種類（例えば、血液、組織、細胞、植物など）や実験の目的に応じて、さまざまな方法が利用できます。分離精製プロセスにおける主な目的は、適切な保存と抽出方法に基づいた RNA 分子の安定化、RNase の阻害、および収量の最大化です。最適な精製法では、酵素活性に影響を及ぼす植物組織由来の複合多糖類やフミン酸、そして逆転写酵素の共通の阻害剤となる塩類や金属イオン、エタノール、フェノールのような内因性の化合物を除去します。一度精製した RNA は –80°C で保存し、できるだけ凍結融解を繰り返さないようにします。
トラブルシューティングのヒント
- 分解を防ぐため、できるだけ RNA サンプルの凍結融解を繰り返し行わないでください。
- 金属イオン要求性のヌクレアーゼによる非特異的な分解を防ぐため、EDTA を含むバッファー液中に RNA を保存してください。
- RNase による汚染がないことを確実にするため、ヌクレアーゼフリー水、あるいは DEPC（ジエチルピロカーボネート）処理水を使用してください。
- ゲル電気泳動などのマイクロ流体力学で RNA の完全性を確認してください。
ステップ 2.ゲノム DNA を除去する
微量のゲノム DNA（gDNA）が RNA と一緒に混ざって精製されることがあります。混入した gDNA は逆転写反応の妨げになり、偽陽性、高バックグラウンド、あるいは RT-qPCR における感度の低下につながる可能性があります。
一般的な方法として、gDNA を除去するために、DNase I を精製 RNA に添加処理します。加えた DNase I は、残留して一本鎖 DNA を分解してしまう可能性があるため、cDNA 合成の前に完全に除去しておく必要があります。ただし、DNase I の不活化処理では、RNA の分解や損失をもたらす可能性があります。
DNase I の代替品として、RNA や一本鎖 DNA に影響のない二本鎖特異的 DNase が、混入した gDNA の除去に利用できます。二本鎖特異的 DNase は熱に不安定な性質を持つため、悪影響のない比較的マイルドな温度（例えば 55°C など）で簡単に不活化できます。このような二本鎖特異的かつ熱不安定性の DNase は、逆転写反応に先立ち、精製 RNA と 37°C で 2 分間反応させるだけで良く、ワークフローとしても合理的です（図 1 ）。
図 1. gDNA gDNA の除去手順：DNase I vs. Invitrogen ezDNase enzyme。 ezDNase enzyme は DNase I と比較してワークフローが短く、手順がシンプルで、RNA への損傷を低減します。ezDNase enzyme はプライマー、ssRNA または cDNA：RNA 複合体を分解しないため、逆転写の前にこの酵素を不活性化することはオプションです。
トラブルシューティングのヒント
- RNA 精製から微量に混入する物質（SDS、EDTA など）は、DNase 活性を阻害する可能性があるため、RNA をエタノールで再沈殿させ、ペレットを 75％エタノールで洗浄した後、ヌクレアーゼフリーの水に溶解してください。
- RNA の完全性への影響が最も少ない gDNA 除去プロトコルを選びます。ezDNase を使用する場合は、37 oC で 5 分間のインキュベーションまで処理を加えます。
- DNase は極めて感受性の高い酵素です。このため、DNase による処理を行う場合は、ボルテックスは避けて、ピペッティングを上下することによってゆっくりと混合することが推奨されます。
- 最も効果的な DNase の除去法として、フェノール／クロロホルム抽出の実行あるいは スピンカラムの使用があげられます。
ステップ 3.逆転写酵素を選択する
分子生物学において最も利用されているのは、トリ骨髄芽球症ウイルス（AMV）やモロニーマウス白血病ウイルス（MMLV）の pol 遺伝子に由来する逆転写酵素です。AMV 由来の逆転写酵素は、実験室で cDNA を合成するために分離された最初の酵素群の 1 つでした。AMV 由来の逆転写酵素は、RNA：cDNA ハイブリッド中の RNA 鎖を分解する強い RNase H 活性を持っているため、短鎖の cDNA フラグメント（< 5 kb）を生成します。
MMLV 由来の逆転写酵素は、モノマー構造であることから、よりシンプルなクローニングや、組み換え体への改変が可能であり、代替品として好まれるようになりました。本酵素は、AMV 由来の逆転写酵素に比べると熱安定性が低い一方で、RNase H 活性が低いため、より長鎖の cDNA（<7 kb）をさらに効率よく合成することができます。
cDNA 合成をさらに改善するために、より RNase H 活性が低く（RNase H ドメインの変異、もしくは RNaseH–）、熱安定性が高く（55°C まで）、そして処理能力を高めた（65 倍以上）MMLV 逆転写酵素の改変体が作られました。これらの性質は、cDNA の鎖長と収率の増加、感度の向上、阻害物質に対する耐性の改善、そして反応時間の短縮といった利点をもたらしました（表 1）。
表 1.一般的な逆転写酵素とその特性
| AMV逆転写酵素 | MMLV逆転写酵素 | 改変型 MMLV 逆転写酵素 （ Invitrogen SuperScript IV 逆転写酵素など） | |
|---|---|---|---|
| RNase H活性 | 高 | 中 | 低 |
| 反応温度 （推奨最高値） | 42°C | 37°C | 55°C |
| 反応時間 | 60 分 | 60 分 | 10 分 |
| ターゲットの鎖長 | ≤5 kb | ≤7 kb | ≤12 kb |
| 相対収率 （困難な条件あるいは最適でない RNA での比較） | 中 | 低 | 高 |
製品のハイライト
トラブルシューティングのヒント
- 少量の RNA を用いて分析を始める場合は、その分量を正確に定量できるよう、広範囲の RNA 入力による高い直線性を示す逆転写試薬を選択してください。
- 分解された RNA、または残存する塩や阻害剤を含む RNA を用いる場合は、分解 RNA に対し効率的に作用する逆転写酵素や塩に耐性のある逆転写酵素を選択するほか、生物学的阻害剤や抽出試薬を持ち越します。
ステップ 4.反応混合液を調製する
逆転写反応の構成成分には、酵素とプライマーに加えて、RNA テンプレート（ゲノム DNA 除去処理済みのもの）、バッファー、dNTP、DTT、RNase 阻害剤、および RNase フリーの水が含まれます（図 2）。
図 2. 逆転写反応の構成成分。
トラブルシューティングのヒント
| 構成品 | 主な特長 |
|---|---|
RNA テンプレート | RNA をインタクトに保つことが極めて重要であり、抽出、調製、保存、実験での使用においては、特別な注意が必要となります（ステップ 1 参照）。
|
反応バッファー |
|
dNTP |
|
DTT |
|
RNA の分解を抑えるために、通常、反応緩衝液に含まれているか、あるいは反応系に添加します。以下の場合：
既知の RNase が多数存在しますので、それらの作用モードと反応要件に基づいて適切な RNase 阻害剤を選択してください。 | |
以下を用い、RNase を除去します。
混入した RNase は簡単なろ過では除去できず、また熱に安定であることから、オートクレーブした水では十分ではありません。 |
トラブルシューティングのヒント
- リアルタイム PCR は RNA を分析するための非常に高感度なツールですが、PCR が標的を増幅するにつれて、エラーも同時に増幅されます。したがって、可能な限り、ばらつきを最小限に抑える必要があります。複数の反応を設定してサンプル間およびウェル間のばらつきを最小限に抑え、再現性を向上させるためには、「マスターミックス」または反応試薬の混合物を使用する必要があります。
- 沈殿しやすい DTT や塩類を完全に溶解させるため、しっかりと試薬を混合してください。
ステップ 5.cDNA 合成を実行する
逆転写反応は 三つのメインステップ、すなわち、プライマーのアニーリング、DNA の重合化、そして酵素の不活化を伴います。これらのステップの温度と時間は、プライマーの選択、ターゲットとなる RNA、そして使用する逆転写酵素によって変わります。
この重要ステップは、DNA の重合化にあります。このステップにおける反応温度と反応時間は、選択したプライマーと使用する逆転写酵素によって変わってきます。ランダムヘキサマーを使用する場合、プライマー伸長のために酵素を加えた後、室温（約 25°C）にて 10 分間、反応液をインキュベートすることをお勧めします。
逆転写酵素はそれぞれに耐熱性が異なり、最も高い最適反応温度が決まっています。耐熱性の逆転写酵素を使えば、より高い温度（50 °C など）での反応が可能であるため、酵素活性に悪影響なく、GC 含量の高い RNA や二次構造を持った RNA を変性させることができます（図 3）。そのような酵素による、高温でのインキュベーションは、cDNA の収量や鎖長を増加させ、遺伝子産物の反映を向上させます。
図 3.熱安定性の影響および逆転写酵素活性への影響オリゴ（dT）プライマーおよび放射性標識 dNTP を用い、さまざまな長さの RNA を含むサンプルを逆転写しました。反応生成物をゲル電気泳動で分離し、オートラジオグラフィーで可視化しました。熱安定性逆転写酵素は、50 °C 以上の温度であっても cDNA 収率は高値にありました。
重合化の時間は逆転写酵素の処理能力に依存し、処理能力とは基質との結合 1 回あたりに組み込まれるヌクレオチドの数で定義されます。例えば、処理能力の低い野生型の MMLV 逆転写酵素では、cDNA の合成に 60 分以上を要します。それに対して、処理能力の高い改変型の逆転写酵素では、9 kb の cDNA を合成するのに 10 分程度しかかかりません。
トラブルシューティングのヒント
- RNA サンプルが高い GC 含量または二次構造を含む場合は、温度を高めて（例えば、50oC）逆転写を行うことで、ヘアピン構造の配列形成を抑制してください。反応温度の上昇に耐える熱安定性の高い逆転写酵素を選択してください。
- プライマー結合の特異性を高めるために高温で逆転写を行うこと、熱安定性逆転写酵素を使用することにより、プライマー設計の問題を抑制することができます。
ステップ 1.サンプルを調製する
RNA は cDNA 合成においてテンプレートの役目をします。トータル RNA は日常的に RT-(q)PCR などのダウンストリームアプリケーションのための cDNA 合成に使用されますが、一方で、特殊なタイプの RNA（例えば、メッセンジャー RNA（mRNA）や miRNA のようなスモール RNA など）は、cDNA ライブラリの構築や miRNA プロファイリングを行う際に、濃縮が必要となる場合があります。
RNA をインタクトに保つことが極めて重要であり、抽出、調製、保存、実験での使用においては、特別な注意が必要となります。RNA の分解を防ぐための最善策は、グローブを着用し、エアロゾルバリアチップでピペット操作を行い、ヌクレアーゼフリーの実験器具と試薬類を使用し、実験エリアを汚染除去することです。
RNA の分離精製には、材料の種類（例えば、血液、組織、細胞、植物など）や実験の目的に応じて、さまざまな方法が利用できます。分離精製プロセスにおける主な目的は、適切な保存と抽出方法に基づいた RNA 分子の安定化、RNase の阻害、および収量の最大化です。最適な精製法では、酵素活性に影響を及ぼす植物組織由来の複合多糖類やフミン酸、そして逆転写酵素の共通の阻害剤となる塩類や金属イオン、エタノール、フェノールのような内因性の化合物を除去します。一度精製した RNA は –80°C で保存し、できるだけ凍結融解を繰り返さないようにします。
トラブルシューティングのヒント
- 分解を防ぐため、できるだけ RNA サンプルの凍結融解を繰り返し行わないでください。
- 金属イオン要求性のヌクレアーゼによる非特異的な分解を防ぐため、EDTA を含むバッファー液中に RNA を保存してください。
- RNase による汚染がないことを確実にするため、ヌクレアーゼフリー水、あるいは DEPC（ジエチルピロカーボネート）処理水を使用してください。
- ゲル電気泳動などのマイクロ流体力学で RNA の完全性を確認してください。
ステップ 2.ゲノム DNA を除去する
微量のゲノム DNA（gDNA）が RNA と一緒に混ざって精製されることがあります。混入した gDNA は逆転写反応の妨げになり、偽陽性、高バックグラウンド、あるいは RT-qPCR における感度の低下につながる可能性があります。
一般的な方法として、gDNA を除去するために、DNase I を精製 RNA に添加処理します。加えた DNase I は、残留して一本鎖 DNA を分解してしまう可能性があるため、cDNA 合成の前に完全に除去しておく必要があります。ただし、DNase I の不活化処理では、RNA の分解や損失をもたらす可能性があります。
DNase I の代替品として、RNA や一本鎖 DNA に影響のない二本鎖特異的 DNase が、混入した gDNA の除去に利用できます。二本鎖特異的 DNase は熱に不安定な性質を持つため、悪影響のない比較的マイルドな温度（例えば 55°C など）で簡単に不活化できます。このような二本鎖特異的かつ熱不安定性の DNase は、逆転写反応に先立ち、精製 RNA と 37°C で 2 分間反応させるだけで良く、ワークフローとしても合理的です（図 1 ）。
図 1. gDNA gDNA の除去手順：DNase I vs. Invitrogen ezDNase enzyme。 ezDNase enzyme は DNase I と比較してワークフローが短く、手順がシンプルで、RNA への損傷を低減します。ezDNase enzyme はプライマー、ssRNA または cDNA：RNA 複合体を分解しないため、逆転写の前にこの酵素を不活性化することはオプションです。
トラブルシューティングのヒント
- RNA 精製から微量に混入する物質（SDS、EDTA など）は、DNase 活性を阻害する可能性があるため、RNA をエタノールで再沈殿させ、ペレットを 75％エタノールで洗浄した後、ヌクレアーゼフリーの水に溶解してください。
- RNA の完全性への影響が最も少ない gDNA 除去プロトコルを選びます。ezDNase を使用する場合は、37 oC で 5 分間のインキュベーションまで処理を加えます。
- DNase は極めて感受性の高い酵素です。このため、DNase による処理を行う場合は、ボルテックスは避けて、ピペッティングを上下することによってゆっくりと混合することが推奨されます。
- 最も効果的な DNase の除去法として、フェノール／クロロホルム抽出の実行あるいは スピンカラムの使用があげられます。
ステップ 3.逆転写酵素を選択する
分子生物学において最も利用されているのは、トリ骨髄芽球症ウイルス（AMV）やモロニーマウス白血病ウイルス（MMLV）の pol 遺伝子に由来する逆転写酵素です。AMV 由来の逆転写酵素は、実験室で cDNA を合成するために分離された最初の酵素群の 1 つでした。AMV 由来の逆転写酵素は、RNA：cDNA ハイブリッド中の RNA 鎖を分解する強い RNase H 活性を持っているため、短鎖の cDNA フラグメント（< 5 kb）を生成します。
MMLV 由来の逆転写酵素は、モノマー構造であることから、よりシンプルなクローニングや、組み換え体への改変が可能であり、代替品として好まれるようになりました。本酵素は、AMV 由来の逆転写酵素に比べると熱安定性が低い一方で、RNase H 活性が低いため、より長鎖の cDNA（<7 kb）をさらに効率よく合成することができます。
cDNA 合成をさらに改善するために、より RNase H 活性が低く（RNase H ドメインの変異、もしくは RNaseH–）、熱安定性が高く（55°C まで）、そして処理能力を高めた（65 倍以上）MMLV 逆転写酵素の改変体が作られました。これらの性質は、cDNA の鎖長と収率の増加、感度の向上、阻害物質に対する耐性の改善、そして反応時間の短縮といった利点をもたらしました（表 1）。
表 1.一般的な逆転写酵素とその特性
| AMV逆転写酵素 | MMLV逆転写酵素 | 改変型 MMLV 逆転写酵素 （ Invitrogen SuperScript IV 逆転写酵素など） | |
|---|---|---|---|
| RNase H活性 | 高 | 中 | 低 |
| 反応温度 （推奨最高値） | 42°C | 37°C | 55°C |
| 反応時間 | 60 分 | 60 分 | 10 分 |
| ターゲットの鎖長 | ≤5 kb | ≤7 kb | ≤12 kb |
| 相対収率 （困難な条件あるいは最適でない RNA での比較） | 中 | 低 | 高 |
製品のハイライト
トラブルシューティングのヒント
- 少量の RNA を用いて分析を始める場合は、その分量を正確に定量できるよう、広範囲の RNA 入力による高い直線性を示す逆転写試薬を選択してください。
- 分解された RNA、または残存する塩や阻害剤を含む RNA を用いる場合は、分解 RNA に対し効率的に作用する逆転写酵素や塩に耐性のある逆転写酵素を選択するほか、生物学的阻害剤や抽出試薬を持ち越します。
ステップ 4.反応混合液を調製する
逆転写反応の構成成分には、酵素とプライマーに加えて、RNA テンプレート（ゲノム DNA 除去処理済みのもの）、バッファー、dNTP、DTT、RNase 阻害剤、および RNase フリーの水が含まれます（図 2）。
図 2. 逆転写反応の構成成分。
トラブルシューティングのヒント
| 構成品 | 主な特長 |
|---|---|
RNA テンプレート | RNA をインタクトに保つことが極めて重要であり、抽出、調製、保存、実験での使用においては、特別な注意が必要となります（ステップ 1 参照）。
|
反応バッファー |
|
dNTP |
|
DTT |
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RNA の分解を抑えるために、通常、反応緩衝液に含まれているか、あるいは反応系に添加します。以下の場合：
既知の RNase が多数存在しますので、それらの作用モードと反応要件に基づいて適切な RNase 阻害剤を選択してください。 | |
以下を用い、RNase を除去します。
混入した RNase は簡単なろ過では除去できず、また熱に安定であることから、オートクレーブした水では十分ではありません。 |
トラブルシューティングのヒント
- リアルタイム PCR は RNA を分析するための非常に高感度なツールですが、PCR が標的を増幅するにつれて、エラーも同時に増幅されます。したがって、可能な限り、ばらつきを最小限に抑える必要があります。複数の反応を設定してサンプル間およびウェル間のばらつきを最小限に抑え、再現性を向上させるためには、「マスターミックス」または反応試薬の混合物を使用する必要があります。
- 沈殿しやすい DTT や塩類を完全に溶解させるため、しっかりと試薬を混合してください。
ステップ 5.cDNA 合成を実行する
逆転写反応は 三つのメインステップ、すなわち、プライマーのアニーリング、DNA の重合化、そして酵素の不活化を伴います。これらのステップの温度と時間は、プライマーの選択、ターゲットとなる RNA、そして使用する逆転写酵素によって変わります。
この重要ステップは、DNA の重合化にあります。このステップにおける反応温度と反応時間は、選択したプライマーと使用する逆転写酵素によって変わってきます。ランダムヘキサマーを使用する場合、プライマー伸長のために酵素を加えた後、室温（約 25°C）にて 10 分間、反応液をインキュベートすることをお勧めします。
逆転写酵素はそれぞれに耐熱性が異なり、最も高い最適反応温度が決まっています。耐熱性の逆転写酵素を使えば、より高い温度（50 °C など）での反応が可能であるため、酵素活性に悪影響なく、GC 含量の高い RNA や二次構造を持った RNA を変性させることができます（図 3）。そのような酵素による、高温でのインキュベーションは、cDNA の収量や鎖長を増加させ、遺伝子産物の反映を向上させます。
図 3.熱安定性の影響および逆転写酵素活性への影響オリゴ（dT）プライマーおよび放射性標識 dNTP を用い、さまざまな長さの RNA を含むサンプルを逆転写しました。反応生成物をゲル電気泳動で分離し、オートラジオグラフィーで可視化しました。熱安定性逆転写酵素は、50 °C 以上の温度であっても cDNA 収率は高値にありました。
重合化の時間は逆転写酵素の処理能力に依存し、処理能力とは基質との結合 1 回あたりに組み込まれるヌクレオチドの数で定義されます。例えば、処理能力の低い野生型の MMLV 逆転写酵素では、cDNA の合成に 60 分以上を要します。それに対して、処理能力の高い改変型の逆転写酵素では、9 kb の cDNA を合成するのに 10 分程度しかかかりません。
トラブルシューティングのヒント
- RNA サンプルが高い GC 含量または二次構造を含む場合は、温度を高めて（例えば、50oC）逆転写を行うことで、ヘアピン構造の配列形成を抑制してください。反応温度の上昇に耐える熱安定性の高い逆転写酵素を選択してください。
- プライマー結合の特異性を高めるために高温で逆転写を行うこと、熱安定性逆転写酵素を使用することにより、プライマー設計の問題を抑制することができます。
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リソース
5 ステップのワークフロー
サポート
For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.