将神经干细胞分化为神经元和神经胶质细胞

本部分中的方案描述了将神经干细胞 (NSC) 体外分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞谱系时所涉及的步骤。NSC 是一类具有自我更新能力的多能干细胞，能够在体外在支持培养系统（如 Gibco StemPro NSC SFM）中进行增殖，并进一步分化成为下游谱系。所述方案主要针对来源于人胚胎干细胞 (ESC) 或诱导型多能干细胞 (iPSC) 的 NSC 进行了优化。试剂浓度和体外分化持续时间方面的某些优化预期适用于大鼠或小鼠等其他物种的 NSC，以及来源于患者特异性 iPSC 的 NSC。

所需材料（适用于所有步骤及子方案）

细胞

• Gibco 人神经干细胞（来源于 H9 hESC）（货号 N7800）

试剂

• Gibco KnockOut D-MEM/F-12（货号 12660）
• Dulbecco 改良伊格尔培养基 (D-MEM)（货号 11995）
• Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (D-PBS)（货号 14040）
• StemPro NSC SFM（货号 A10509-01）
• N-2 补充剂（货号 17502）
• Gibco B-27 无血清补充剂（货号 17504）
• Gibco Neurobasal 培养基（货号 21103）
• 真菌-抗生素溶液（货号 15240）
• 胎牛血清，适用于 ES 细胞的 FBS（货号 16141）
• Gibco GlutaMAX-I（货号 35050）
• 重组人碱性 FGF (bFGF) (AA 10–155)（货号 PHG0024）
• 重组人 EGF（货号 PHG0314）
• Gibco CELLstart CTS（货号 A10142-01）
• Gibco Geltrex 低生长因子基底膜基质（货号 12760）
• 多聚-L-鸟氨酸（Sigma，货号 P3655）
• 层黏连蛋白（货号 23017）
• 二丁酰 cAMP（Sigma，货号 D0627）
• T3（Sigma，货号 D6397）
• EM 级多聚甲醛（Electron Microscopy Services，货号 19208）
• Invitrogen ProLong Gold 抗淬灭试剂（货号 P36930）

StemPro NSC SFM 完全培养基

StemPro NSC SFM 完全培养基包括 KnockOut D-MEM/F-12 以及 Gibco StemPro 神经补充剂、EGF、bFGF 和 GlutaMAX-I。在 2-8°C 下避光储存时，完全培养基可稳定放置 4 周。

制备 100 mL 完全培养基需要：

1. 使用 0.1% BSA 溶液（溶于 KnockOut D-MEM/F-12）复溶 bFGF 与 EGF，使得浓度为 100 μg/mL。每 100 mL 完全培养基中各需要 20 μL。分装冷冻未使用的部分。
2. 在无菌条件下混合下列组分。如需使用更大体积，请按比例增加组分用量：如需要，向每 100 mL 完全培养基中加入 1 mL 真菌-抗生素溶液。

注：您可能在解冻 StemPro 神经补充剂的过程中发现白色沉淀；完全解冻或溶解后该沉淀将消失。

神经分化培养基

神经分化培养基需要在 Neurobasal 培养基中补充 B-27 无血清补充剂和 GlutaMAX-I。在 2-8°C 下避光储存时，神经分化培养基可稳定放置 2 周。

要制备 100 mL 神经分化培养基，请在无菌条件下混合以下组分。如需使用更大体积，请按比例增加组分用量。如需要，向每 100 mL 培养基中加入 1 mL 真菌-抗生素溶液。

如需达到更快的分化效果，请按照分化方案中所描述的方法，在第 7 天添加二丁酰 cAMP（Sigma，货号 0627），使得最终浓度为 0.5 mM，持续 3 天。

星形胶质细胞分化培养基

星形胶质细胞分化培养基需要在 D-MEM 中补充 N-2、GlutaMAX-I 和 FBS。在 2-8°C 下避光储存时，星形胶质细胞分化培养基可稳定放置 4 周。

要制备 100 mL 星形胶质细胞分化培养基，请在无菌条件下混合以下组分。如需使用更大体积，请按比例增加组分用量。如需要，向每 100 mL 培养基中加入 1 mL 真菌-抗生素溶液。

少突胶质细胞分化培养基

少突胶质细胞分化培养基需要在 Neurobasal 培养基中补充 B-27、GlutaMAX-I 和 T3。在 2-8°C 下避光储存时，少突胶质细胞分化培养基可稳定放置 2 周。

要制备 100 mL 少突胶质细胞分化培养基，请在无菌条件下混合以下组分。如需使用更大体积，请按比例增加组分用量。如需要，向每 100 mL 培养基中加入 1 mL 真菌-抗生素溶液。

* 您可以在蒸馏水中制备 30 μg/mL 的 T3 储备液 (1,000X)。对 T3 储备液进行过滤除菌。

使用 CELLstart 底物包被培养容器

1. 在含钙和镁的 D-PBS 中按 1:100 的比例稀释 CELLStart CTS（即，将 50 μL CELLStart CTS 加入 5 mL D-PBS 中）。
2. 使用 CELLStart CTS 工作溶液包被培养容器表面（T-75：14 mL，T-25：7 mL，60 mm 培养皿：3.5 mL，35 mm 培养皿：2 mL）。
3. 在 37°C、含 5% CO₂ 的湿润环境中孵育培养容器 1 小时。
4. 从培养箱中取出容器，储存至使用。临使用前，去除所有的 CELLStart CTS 溶液，并将其替换为完全 StemPro NSC SFM。

注：您应提前包被平板并将它们储存于 4°C 下，使用 Thermo Scientific™ Parafilm™ 紧密包裹储存长达 2 周。请在临时用前去除 CELLStart CTS 溶液。请确保平板不会变干。

用 Geltrex 基质包被培养容器

1. 在 4°C 下过夜解冻 Geltrex 基质瓶，以防止聚合。第二天，在 4°C 下使用 D-MEM/F-12 按 1:2 的比例稀释 Geltrex 基质，制成 100X 储备液，使用冰盒来保持瓶体处于低温状态。在 50 mL 锥形管（在冰上预冷）中快速制备 0.5 mL 等份试液，并将管储存于 -20°C 下。
2. 在 4°C 下缓慢解冻 1 管 Geltrex 基质（0.5 mL，如上分装），并添加 49.5 mL 低温 D-MEM/F-12（1:100 稀释）。轻轻混匀。
3. 使用 Geltrex 基质溶液覆盖各培养板的整个表面（35 mm 培养皿：1.5 mL，60 mm 培养皿：3 mL，T-25 培养瓶：5 mL）。
4. 使用 Parafilm 密封每一个培养皿以防止干燥，于室温条件下在层流净化罩中孵育 1 小时。
5. 临使用前，去除所有的 Geltrex 基质溶液，使用含钙和镁的 D-PBS 洗涤一次，并替换为预热的完全培养基。

注：您可在 4°C 下储存 Geltrex 基质处理过的培养皿，使用 Parafilm 紧密包裹储存长达 1 个月。请在临使用前去除 Geltrex 基质溶液。

使用多聚-L-鸟氨酸和层黏连蛋白包被培养容器

1. 使用细胞培养级蒸馏水溶解多聚-L-鸟氨酸，制成 10 mg/mL 储备液 (500X)。将溶液分装，使用前在 -20°C 下储存。
2. 在 2-8°C 下缓慢解冻层黏连蛋白，并在细胞培养级蒸馏水中制备 10 μg/mL 工作溶液。将工作溶液分装至聚丙烯管中，并将这些管储存于 -20°C 下直至使用。避免反复冻融。 
   注：层黏连蛋白解冻过快时可能会形成凝胶。
3. 在细胞培养级蒸馏水中以 1:500 的比例稀释多聚-L-鸟氨酸储备液，制成 20 μg/mL 工作溶液。
4. 使用多聚-L-鸟氨酸工作溶液包被培养容器（含或不含盖玻片）表面（T-75：14 mL，T-25：7 mL，60 mm 培养皿：3.5 mL，35 mm 培养皿：2 mL）。
5. 在 4°C 下过夜孵育培养容器或在 37°C 下孵育培养容器 1 小时。
6. 用无菌水冲洗培养容器两次。
7. 使用层黏连蛋白工作溶液包被培养容器（含或不含盖玻片）表面（T-75：14 mL，T-25：7 mL，60 mm 培养皿：3.5 mL，35 mm 培养皿：2 mL）。
8. 在 4°C 下过夜孵育培养容器或在 37°C 下孵育培养容器 2 小时。
9. 使用不含钙或镁的 D-PBS 冲洗培养容器，并将盛装有 D-PBS 的培养容器储存至使用。临使用前，去除所有的 D-PBS，并将其替换为完全 StemPro NSC SFM。
   注：您应提前包被平板并将它们储存于室温下，使用 Parafilm 紧密包裹储存长达 1 周。请在临使用前去除 D-PBS。请确保平板不会变干。

神经干细胞 (NSC) 会作为祖细胞增殖数次，即使完全生长培养基被适当的分化培养基替换之后也是如此。如果细胞达到 90% 的汇合度，则可能仍需要按照 1:2 的比例传代细胞。然而，当细胞达到第 9-10 天的分化阶段时请勿对其进行传代，这时在传代过程中可能会损伤这些细胞。

分化为神经元

1. 在完全 StemPro NSC SFM 中，将神经干细胞铺至多鸟氨酸和层黏连蛋白包被的培养皿上，铺板浓度为
   2.5-5 × 10⁴ 个细胞/cm²。
2. 2 天后，将培养基更换为神经分化培养基。每 3-4 天更换一次消耗的培养基。
3. 如需达到更快的分化效果，从分化第 7 天开始，每日向分化培养基中加入 0.5 mM 二丁酰 cAMP（Sigma，货号 D0627），持续 3 天。

重要提示！如果细胞已经分化为神经元，请勿将其暴露于空气中。

分化为星形胶质细胞

1. 在完全 StemPro NSC SFM 中，将 NSC 铺至 Geltrex 基质包被的培养皿上，铺板浓度为 2.5 × 10⁴ 个细胞/cm²。
2. 2 天后，将培养基更换为星形胶质细胞分化培养基。每 3-4 天更换一次消耗的培养基。

分化为少突胶质细胞

1. 在完全 StemPro NSC SFM 中，将 NSC 铺至多鸟氨酸和层黏连蛋白包被的培养皿上，铺板浓度为
   2.5-5 × 10⁴ 个细胞/cm²。
2. 2 天后，将培养基更换为少突胶质细胞分化培养基。每 3-4 天更换一次消耗的培养基。

制备多聚甲醛固定溶液

20% 多聚甲醛 (PFA) 储备液

1. 向 20 g EM 级多聚甲醛（Electron Microscopy Services，货号 19208）中加入 PBS，使最终体积达到 100 mL。
2. 加入 0.25 mL 10 N NaOH，并在 60°C 下使用磁力搅拌器加热溶液，直至溶液完全溶解。
3. 通过 0.22 μm 过滤器过滤溶液，并在冰上进行冷却。请确保 pH 值为 7.5-8.0。
4. 将此溶液以 2 mL 为单位分装至 15 mL 试管中，在干冰上冷冻试管，并将它们储存于 -20°C 下。

用于固定的 4% PFA

1. 向含有 2 mL 20% PFA 的各 15 mL 试管中加入 8 mL PBS，在 37°C 水浴中解冻各试管。
2. 溶液一经溶解，就将试管置于冰上冷却。

细胞固定

1. 去除培养基，使用 D-PBS 轻轻冲洗细胞一次，不要冲掉细胞。
2. 在室温下用新制备的 4% 多聚甲醛固定溶液 (PFA) 固定细胞 15 分钟。
3. 用含有 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 D-PBS 冲洗 3 次。
4. 固定后检查细胞的存在情况。
5. 如下所述进行染色。您可在染色前于 4°C 下在 D-PBS 中储存玻片长达 3-4 周。不要让玻片变干。
   

细胞染色

1. 在封闭缓冲液（5% 的二抗宿主物种血清，1% BSA，0.1% Thermo Scientific™ Triton™-X，溶于含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 D-PBS）中孵育细胞 30-60 分钟。
   注：如果您使用的是如 GalC 一类的表面抗原，则封闭缓冲液中无需添加 Triton-X。
2. 去除封闭缓冲液，并在 5% 血清稀释的一抗中于 4°C 下过夜孵育细胞。请确保细胞表面均匀覆盖抗体溶液。
3. 用含有 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 D-PBS 洗涤细胞 3 次，持续 5 分钟（如果使用的是玻片，则使用带磁力搅拌器的染色皿）。
4. 在 37°C 避光条件下使用荧光标记的二抗（5% 血清，溶于含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 D-PBS）孵育细胞 30-45 分钟。
5. 使用含有 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 D-PBS 洗涤细胞 3 次，最后一次洗涤的过程中，使用 DAPI 溶液 (3 ng/mL) 复染细胞 5-10 分钟，再使用 D-PBS 冲洗。
6. 如需要，每张玻片可以用 3 滴 ProLong Gold 抗淬灭试剂封片并用盖玻片密封。您可将玻片避光储存于 4°C 下。

下表列举了一些疑难情况的发生原因与解决方案，用于帮助针对您的潜在分化问题进行疑难解答。

1. Trujillo CA, Schwindt TT, Martins AH, et al.(2009) Novel perspectives of neural stem cell differentiation: from neurotransmitters to therapeutics.Cytometry A 75:38–53.
2. Elkabetz Y, Studer L (2008) Human ESC-derived neural rosettes and neural stem cell progression.Cold Spring Harb Symp Quant Biol 73:377–387.
3. Denham M, Dottori M (2009) Signals involved in neural differentiation of human embryonic stem cells.Neurosignal 17:234–241.

LT154     2011 年 3 月 17 日