神经干细胞的无异种成分培养和分化为神经元

随着神经科学领域正在接近实现神经干细胞衍生疗法，人们越来越清晰地认识到临床级神经细胞系开发早期试剂选择的重要性。更具体地说，使用含无异种成分或仅含人源或重组成分的培养基和补充剂组合对成品的安全性和可追溯性至关重要。

抗坏血酸储备液

1. 用 8.634 mL 蒸馏水重悬 500 mg 抗坏血酸粉末，制备 200 mM 储备液。注：抗坏血酸的分子量为 289.54。
2. 通过 0.22 μm 过滤器过滤抗坏血酸溶液，对其进行灭菌。
3. 将抗坏血酸溶液分装至无菌管中，可在 -20°C 下避光储存长达 6 个月。

bFGF 和 EGF 储备液

1. 要制备 bFGF 或 EGF 的 20 μg/mL 储备液，将 10 μg bFGF 或 EGF 重悬于 500 μL 0.1% 人血清白蛋白 DPBS CTS™（不含氯化钙、不含氯化镁）溶液中。
2. 将 bFGF 或 EGF 储备液分装至无菌管中，可在 -20°C 下避光储存长达 6 个月。

无异种成分增殖培养基

采用完全无异种成分增殖培养基培养神经干细胞。它由含 GlutaMAX™-I CTS™ 补充剂、抗坏血酸、bFGF、EGF、N-2 补充剂 CTS™ 和 B-27® 补充剂 XenoFree CTS™ 的 KnockOut™ DMEM-F12 CTS™ 培养基组成。

1.要制备 100 mL 完全无异种成分增殖培养基，请在无菌条件下混合以下组分：

2.完全无异种成分增殖培养基可以在 2-8°C 下避光储存最长 2 周。

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无异种成分分化培养基用于将神经干细胞分化为神经元，其由含有 GlutaMAX™-I CTS™ 补充剂、抗坏血酸和 B-27® 补充剂 XenoFree CTS ™ 的 Neurobasal® 培养基 CTS™ 组成。

1.要制备 100 mL 完全无异种成分分化培养基，请在无菌条件下混合以下组分：

2.完全无异种成分分化培养基可以在 2-8°C 下避光储存最长 2 周。

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完全无异种成分培养基用于培养神经元，其由含有 GlutaMAX™-I CTS™ 补充剂、抗坏血酸和 B-27® 补充剂 XenoFree CTS™ 的 Neurobasal® 培养基 CTS™ 组成。

1.要制备 100 mL 完全无异种成分培养基，请在无菌条件下混合以下组分：

2.完全无异种成分培养基可以在 2-8°C 下避光储存最长 2 周。

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使用 CELLstart™ CTS™ 底物包被培养容器

1. 在 DPBS CTS™（含钙和镁）中按照 1:100 的比例稀释 CELLstart™ CTS™（即将 50 μL 底物稀释到 5 mL DPBS 中）。注：CELLstart™ CTS™ 底物不应冷冻、涡旋或由于可能形成凝胶而进行高强度搅拌。
2. 使用 CELLstart™ CTS™ 底物的工作溶液包被培养容器表面（T-75：14 mL，T-25：7 mL，60 mm 培养皿：3.5 mL，35 mm 培养皿：2 mL）。
3. 在 37°C、含 5% CO2 的湿润环境中孵育培养容器 1 小时。
4. 从培养箱中取出容器，储存至使用。临使用前去除所有的 CELLstart™ CTS™ 底物溶液，并用完全无异种成分增殖培养基填充容器。注：您可以提前包被平板并将它们储存于 4°C 下，使用 Parafilm® 实验室薄膜紧密包裹储存长达 2 周。请在临使用前移除 CELLstart™ CTS™ 溶液。请确保平板不会变干。

用人层黏连蛋白包被培养容器

1. 在 2-8°C 下缓慢溶解层黏连蛋白，并在无菌蒸馏水中制备 10 μg/mL 工作溶液。将工作溶液分装至聚丙烯管中，并将这些管储存于 -20°C 下直至使用。避免反复冻融。注：层黏连蛋白解冻过快时可能会形成凝胶。
2. 使用层黏连蛋白工作溶液包被培养容器表面（T-75：14 mL，T-25：7 mL，60 mm 培养皿：3.5 mL，35 mm 培养皿：2 mL）。
3. 在 4°C 下过夜孵育培养容器或在 37°C 下孵育培养容器 2 小时。
4. 用不含氯化钙、不含氯化镁的 DPBS CTS™ 冲洗培养容器，并将盛装有 DPBS 的容器储存至使用。临使用前去除所有的 DPBS，并将其替换为完全培养基。注：您可以提前包被平板并将它们储存于 4°C 下，使用 Parafilm® 实验室薄膜紧密包裹储存长达 2 周。请在临使用前移除 DPBS。请确保平板不会变干。如果层黏连蛋白包被板变色或表面形成蜘蛛网，请勿使用。

用多聚-L-赖氨酸或多聚-D-赖氨酸包被培养容器

1. 在无菌蒸馏水中制备多聚-L-赖氨酸或多聚-D-赖氨酸的 10 μg/mL 工作溶液。
2. 使用多聚-L-赖氨酸或多聚-D-赖氨酸的工作溶液包被培养容器表面（T-75：14 mL，T-25：7 mL，60 mm 培养皿：3.5 mL，35 mm 培养皿：2 mL）。
3. 室温孵育培养容器 1 小时。
4. 从包被的容器中吸出多聚-L-赖氨酸或多聚-D-赖氨酸溶液，用无菌蒸馏水冲洗容器表面两次。
   注：确保彻底冲洗培养容器，因为过多的多聚-D-赖氨酸对细胞有毒性。
5. 将包被后的容器开口放于层流罩内直到完全干燥。您可以立即使用干燥平板，或使用 Parafilm® 实验室薄膜紧密包裹后在 4°C 下储存长达 1 周。

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解冻神经干细胞

1. 将 10 mL 完全无异种成分增殖培养基预热至 37°C。
2. 从液氮储存罐中取出一管冷冻 NSC 转移至 37°C 水浴中。必须立即进行转移以防止晶体形成。
3. 将冻存管浸入 37°C 水浴中，不要浸没管盖，以解冻细胞。在解冻时轻轻旋转冻存管。
4. 当只剩余少量冰晶时，将冻存管从水浴中取出，并使用 95% 乙醇对其外部进行灭菌。在打开冻存管之前，让乙醇蒸发。
5. 将解冻的细胞轻轻转移到 15 mL 无菌管中，并缓慢添加预热完全培养基，使总体积达到 5 mL。注：加入培养基的同时，轻轻地来回移动管以混合细胞。该操作可减少细胞的渗透休克。
6. 以 300 × g 离心细胞 4 分钟。吸出并弃去上清液。
7. 在 5 mL 预热的完全无异种成分增殖培养基中重悬细胞，并测定细胞的总数和活力百分比。
8. 将解冻的细胞接种于 CELLstart™ CTS™ 底物包被的培养容器中，使得最终接种密度为 1 × 10⁵ 个细胞/cm2。注：在临使用培养容器之前，从容器中吸出包被溶液。
9. 在 37°C、含 5% CO₂ 的湿润环境 (90%) 中孵育细胞。
10. 第二天，用新制备的无异种成分增殖培养基替换消耗的培养基，之后每隔一天更换培养基。
11. 一旦培养物达到完全汇合，以 1:4 的传代比率或以 1 × 10⁵ 个细胞/cm2 的接种密度传代细胞。您也可以将细胞冷冻于液氮中长期储存。

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神经干细胞的培养和增殖

1. 制备 CELLstart™ CTS™ 底物包被的培养容器并将无异种成分增殖培养基预热至 37°C。
2. 在不含氯化钙、不含氯化镁的 DPBS CTS™ 中将 TrypLE™ Select CTS™ 解离酶稀释至 0.5X。
3. 使用不含氯化钙、不含氯化镁的 DPBS CTS™ 冲洗待传代的细胞一次，每 10 cm2 培养表面积使用约 2 mL DPBS。
4. 向细胞中加入 0.5X TrypLE™ Select CTS™ 溶液（每 10 cm2 培养表面积加入约 1 mL 溶液），并在室温下或 37°C 培养箱中孵育 3 分钟。如果培养物密集，则可延长孵育时间至细胞开始分离和聚集。
5. 通过上下吹吸 TrypLE™ Select CTS™ 溶液轻轻冲洗培养容器，使细胞脱离容器。避免产生气泡。
6. 采集细胞并转移至 15 mL 锥形管中。
7. 通过在容器中加入 TrypLE™ Select CTS™ 溶液 4X 体积的完全无异种成分增殖培养基（每 10 cm2 培养表面积加入约 4 mL 培养基），终止细胞解离反应。通过在细胞层表面吹吸数次使培养基分散。
8. 以 300 × g 离心细胞 4 分钟。吸出并弃去上清液。
9. 在完全无异种成分增殖培养基中重悬细胞，使得最终浓度为 1 ×10⁴ 个细胞/μL。
10. 将解冻的细胞接种于 CELLstart™ CTS™ 底物包被的培养容器中，使得最终接种密度为 1 × 10⁵ 个细胞/cm2，将其置于含 5% CO₂、37°C 的湿润培养箱中
11. 第二天，用新制备的无异种成分增殖培养基替换消耗的培养基，之后每隔一天更换培养基。

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冷冻神经干细胞 

1. 制备由 20% DMSO 和 80% 无异种成分增殖培养基组成的 2X 冷冻溶液。将冻存培养基放置在冰上直至使用。
2. 按上文“神经干细胞的培养和增殖”中所述的方法收获细胞。
3. 在完全无异种成分增殖培养基中重悬细胞，使得最终浓度为 2 × 10⁶ 个细胞/mL。
4. 向重悬细胞中逐滴加入与重悬所用培养基等量的 2X 冻存培养基。注：1X 冻存培养基中的 DMSO 最终浓度为 10%，最终细胞浓度为 1 × 10⁶ 个细胞/mL。
5. 在冻存管中制备 1 mL 等份试液（1× 10⁶ 个细胞），并将其置于异丙醇冻存盒中。将异丙醇冻存盒与冻存管置于 -80°°C 下过夜。
6. 第二天，将冷冻的冻存管转移至液氮气罐（气相）进行长期储存。
   注：您可于液氮保存冻存管 24 小时之后，按照上文“解冻神经干细胞”中所阐述的程序来检查冷冻细胞的活力和回收率。

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图 1 使用 B-27® 补充剂 XenoFree CTS™ 制备的无异种成分增殖培养基中神经干细胞的培养动力学。10 天后，用 0.5 × 10⁶ 个细胞接种的初始培养物产生 4.0 × 10⁷ 个细胞。

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图 2 使用 B-27® 补充剂 XenoFree CTS™ 增殖的 NSC（p3，左上角）的特征为具有 NSC 表型标记物 Sox1（右上，绿色）和巢蛋白（左下方，绿色），并进一步分化为神经元（右下，红色）。

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1. 制备层黏连蛋白包被的培养容器并将无异种成分分化培养基预热至 37°C。
2. 在不含氯化钙、不含氯化镁的 DPBS CTS™ 中将 TrypLE™ Select CTS™ 解离酶稀释至 0.5X。
3. 使用不含氯化钙、不含氯化镁的 DPBS CTS™ 冲洗神经干细胞一次，每 10 cm2 培养表面积使用约 2 mL DPBS。
4. 向细胞中加入 0.5X TrypLE™ Select CTS™ 溶液（每 10 cm2 培养表面积加入约 1 mL 溶液），并在室温下或 37°C 培养箱中孵育 3 分钟。如果培养物密集，则可延长孵育时间至细胞开始分离和聚集。
5. 通过上下吹吸 TrypLE™ Select CTS™ 溶液轻轻冲洗培养容器，使细胞脱离容器。避免产生气泡。
6. 采集细胞并转移至 15 mL 锥形管中。
7. 通过在容器中加入 TrypLE™ Select CTS™ 溶液 4X 体积的完全无异种成分增殖培养基（每 10 cm2 培养表面积加入约 4 mL 培养基），终止细胞解离反应。通过在细胞层表面吹吸数次使培养基分散。
8. 以 300 × g 离心细胞 4 分钟。吸出并弃去上清液。
9. 从层黏连蛋白包被的培养容器中吸出层黏连蛋白溶液，并立即添加适量的无异种成分分化培养基来防止培养容器干燥。
10. 将神经干细胞接种于层黏连蛋白包被的培养容器中，使得最终接种密度为 1 × 10⁵ 个细胞/cm2，将其置于 37°C、含 5% CO₂ 的湿润培养箱中
11. 第二天，将培养基更换为新制备的无异种成分分化培养基，此后每 2-3 天用新制备的无异种成分分化培养基替换一半培养基。

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图 3 人 NSC 分化 7 天。观察神经突延伸（左，相差图像；比例尺= 200 μm）并通过 qPCR 检查神经丝表达的上调（右；根据 β-肌动蛋白对表达进行归一化）。

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图 4  使用 B-27® 补充剂 XenoFree CTS™ 将人诱导型多能干细胞分化为 NSC，并在完全 XenoFree 分化培养基（含有 Neurobasal® 培养基 CTS™ 和 B-27® 补充剂 XenoFree CTS™）中将衍生的 NSC 进一步分化为神经元。衍生 NSC 的相差图像（左）、衍生 NSC 的表型标记物表达（中，红色 = Sox1，绿色 = 巢蛋白）以及 NSC 分化为神经元 2 周（将其神经突进行染色）（右；β III 微管蛋白 = 绿色）

1. 将 10 mL 完全无异种成分培养基预热至 37°C。
2. 用无菌蒸馏水冲洗多聚-L-赖氨酸或多聚-D-赖氨酸包被的培养容器两次，并加入适当体积的预热完全无异种成分培养基。
3. 用细胞接种多聚-L-赖氨酸或多聚-D-赖氨酸包被培养容器，使得最终接种密度为 2 × 10⁴–5 × 10⁴ 个细胞/cm2，并在 37°C 下孵育过夜。
4. 第二天，将培养基更换为新制备的无异种成分培养基，此后每 2-3 天用新制备的无异种成分培养基替换一半培养基。

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图 5 人海马神经元、皮层神经元和 Gibco® Episomal iPSC 衍生神经元（右）培养。培养海马神经元（左）和皮层神经元（中）一周后，用钙黄绿素 AM（绿色）对活细胞进行染色并使用 Dcx（红色）对神经元进行染色。培养 Gibco® Episomal iPSC 衍生神经元（右）一周后，使用 Dcx（绿色）对细胞进行染色，用 DAPI（蓝色）复染细胞核。

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LT175  修订版 2013 年 2 月 21 日