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介绍

LIVE/DEAD 活力/细胞毒性检测试剂盒提供了一种双色荧光细胞活力检测方法，该方法的基本原理是使用可测量两个公认细胞活力参数（即，细胞内酯酶活性和细胞膜完整性）的探针对活和死神经干细胞 (NSC) 进行同时测定。

聚阴离子染料钙黄绿素 AM 能够很好地保留在活细胞中，在活细胞中产生强烈而均匀绿色荧光（激发/发射波长约 495 nm/约 515 nm），而溴乙啡锭二聚体-1 (EthD-1) 则会进入膜受损的细胞，在死细胞中产生亮红色荧光（激发/发射波长约 495 nm/约 635 nm）。

本文提供了对贴壁细胞进行荧光显微镜或微孔板分析或对悬浮细胞进行流式细胞分析的方案。

所需材料

细胞

  • 贴壁或悬浮 NSC

培养基和试剂

  • LIVE/DEAD 活力/细胞毒性检测试剂盒（货号 L-3224）
    • 钙黄绿素 AM
    • 溴乙啡锭二聚体-1 (EthD-1)
  • Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (D-PBS)（货号 14040）

专用工具

  • 荧光显微镜

注：可采用常规荧光素长通滤光片对钙黄绿素和 EthD-1 进行同时观察。也可对这些染料的荧光进行单独观察；钙黄绿素可通过标准荧光素带通滤光片进行观察，EthD-1 可通过碘化丙啶或 Texas Red 染料滤光片进行观察。

制备试剂

按照以下步骤制备 LIVE/DEAD 活力/细胞毒性检测试剂盒中的试剂：

  1. 从冷冻冰箱中取出试剂盒中提供的储备液，让其升至室温。Gibco 神经生物学方案手册 | 65 细胞分析
  2. 向 10 mL 无菌组织培养级 D-PBS 中加入 20 μL 提供的 2 mM EthD-1 储备液（组分 B）。涡旋以确保充分混合。得到约 4 μM 的 EthD-1 溶液。
  3. 向 10 mL EthD-1 的 D-PBS 溶液中加入 5 μL 提供的 4 mM 钙黄绿素 AM 储备液（组分 A），混合试剂。涡旋所得溶液以确保充分混合。

注：本试剂混合物适用于大多数神经细胞。对于酯酶活性较高的细胞，您可能需要从较低浓度的钙黄绿素 AM 开始。有关更多信息，请参阅 LIVE/DEAD 活力/细胞毒性检测试剂盒随附的用户手册。

得到的工作溶液（约 2 μM 钙黄绿素 AM 和约 4 μM EthD-1）可随时使用。DMSO 的最终浓度 ≤ 0.1%，该水平通常对大多数细胞无害。

注：在每次进行细胞铺板前，制备新的包被培养容器。使用前无需冲洗培养容器。

方法

测定贴壁细胞的活力

贴壁 NSC 可在无菌玻璃盖玻片上或多孔板中培养。

  1. 在检测前，吸出培养基上清液，并用相同体积的 D-PBS 轻轻洗涤细胞，以去除或降低任何血清酯酶活性。
    注：血清酯酶可通过水解钙黄绿素 AM 使细胞外荧光稍微增加。
  2. 荧光显微镜检查：将一等份细胞悬浮液转移到盖玻片上，然后置于带盖的皮氏培养皿中，让细胞在 37°C 下沉降在表面上。然后在盖玻片上添加 100-150 μL 制备的 LIVE/DEAD 试剂，使溶液覆盖所有细胞。微孔板读数仪：向微孔板的各孔中加入一等份细胞悬浮液，加液量至少足以覆盖各孔的底部。然后加入体积大约相等的已制备 LIVE/DEAD 试剂。
  3. 室温孵育细胞 10-30 分钟。使用适当的激发和发射滤光片测量荧光。
  4. 在荧光显微镜下或使用荧光微孔板读数仪分析样本。

 

通过流式细胞分析测定悬浮细胞的活力

在继续操作之前，让所有试剂达到室温。

  1. 用 DMSO 将钙黄绿素 AM（组分 A）稀释 80 倍，制备 50 μM 工作溶液（例如，向 158 mL DMSO 中加入 2 mL 钙黄绿素 AM）。
  2. 为每次检测制备 1 mL 细胞悬浮液，细胞密度为 0.1 × 106 至 5 × 106 个细胞/mL。细胞可以悬浮于培养基中，也可以悬浮于缓冲液中。
  3. 向每 mL 细胞中加入 2 μL 的 50 μM 钙黄绿素 AM 工作溶液和 4 μL 的 2 mM EthD-1 储备液。混合样本。
  4. 室温避光孵育细胞 15-20 分钟。
  5. 孵育期后尽快（1-2 小时内）通过流式细胞术（使用 488 nm 激发波长并测量钙黄绿素的绿色荧光发射 [即 530/30 带通] 和 EthD-1 的红色荧光发射 [即 610/20 带通]）对染色细胞进行分析。
  6. 对细胞设门以去除细胞碎片。使用单色染色细胞进行标准补偿。细胞群应分成两组：活细胞将显示出绿色荧光，死细胞将显示出红色荧光（图 1）。
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图 1 - 使用 LIVE/DEAD 活力/细胞毒性试剂盒进行流式细胞活力分析。按照提供的方案，用钙黄绿素 AM 和 EthD-1 对活的和乙醇固定的人 B 细胞 1:1 混合物进行染色。使用 488 nm 激发波长进行流式细胞分析。得到的双变量频率分布显示绿色荧光 (530 nm) 活细胞群与红色荧光 (585 nm) 死细胞群明显分开。

LT144                    2011 年 3 月 17 日