皮层和海马神经元的分离、培养和鉴定

在无血清条件下培养原代神经元的技术，有助于更严格地控制神经科学研究。一些无血清培养基和补充剂实现了神经元的低密度培养，从而可以研究单个神经元和突触。这对于有血清的培养基而言是不可能的——除非使用神经胶质细胞作为饲养层。在有血清的培养基中，神经胶质细胞不断生长分裂，所以必须使用细胞毒性的有丝分裂抑制剂。血清中还含有不同水平的未知生长因子、激素、维生素以及蛋白。本页详细描述了使用无血清培养基和补充剂分离及培养神经细胞的过程。

所需材料

分离大鼠脑细胞

• Hibernate-E 培养基（货号 A12476-01）
• Gibco B-27 Plus 神经元培养系统 (A3653401)
  • 包含 Neurobasal Plus 培养基 (A3582901) 和 B-27 Plus 补充剂 (A3582801)
• Hibernate-E 培养基，不含 Ca2+（BrainBits LLC，货号 HE-Ca）
• 木瓜蛋白酶（Worthington，货号 LS003119）
• 台盼蓝染色剂（货号 15250-061）
• 巴斯德吸管
• 血细胞计数器、细胞计数仪和台盼蓝或 Countess® 自动细胞
• 计数仪（货号 C10227）
• 锥形管（15 mL、50 mL）

培养胚胎神经元

• 多聚-D-赖氨酸氢溴酸盐（Sigma，货号 P-6407）
• 48 孔板或 8 室玻片
• 蒸馏水（货号 15230-162）
• Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (D-PBS)（货号 14040-141）
• Gibco B-27 Plus 神经元培养系统 (A3653401)
  • 包含 Neurobasal Plus 培养基 (A3582901) 和 B-27 Plus 补充剂 (A3582801)

免疫细胞化学

• 山羊血清（货号 16210-064）
• 小鼠抗 MAP2 抗体（货号 13-1500）
• 兔抗 GFAP 抗体（货号 08-0063）
• Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG (H+L)（货号 A-11029）
• Alexa Fluor 594 山羊抗兔 IgG (H+L)（货号 A-11037）
• 4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐 (DAPI)（货号 D1306）
• ProLong Gold 抗淬灭试剂（货号 P36930）
• EM 级多聚甲醛（Electron Microscopy Services，货号 19208）

Hibernate-E 完全培养基

Hibernate-E 是一种无血清、营养基础培养基，用于在环境 CO ₂ (0.2%) 条件下短期维持大鼠神经元培养物和长期储存活的脑组织。完全培养基含有 Hibernate-E 培养基，并添加有 B-27 Plus 无血清补充剂。

要制备 100 mL 的 Hibernate-E 完全培养基，请在无菌条件下混合以下组分。如需使用更大体积，请按比例增加组分用量。

Neurobasal 完全培养基

Neurobasal 完全培养基需要在 Neurobasal Plus 培养基中添加 B-27 Plus 补充剂。完全培养基在 2-8°C 下避光储存时可稳定保存 2 周。要制备 100 mL Neurobasal Plus 完全培养基，请在无菌条件下混合以下组分。如需使用更大体积，请按比例增加组分用量。

如果用于大鼠原代海马神经元培养，Neurobasal Plus 完全培养基还需额外添加 25 μM 的 L-谷氨酸，直到培养的第四天。

用多聚-D-赖氨酸包被培养容器

1. 在蒸馏水中制备 2 mg/mL 多聚-D-赖氨酸储备液。
2. 用 D-PBS 按 1:40 稀释多聚-D-赖氨酸储备液，制备 50 μg/mL 工作溶液（即 5 mL 的 D-PBS 中加入 125 μL 的多聚-D-赖氨酸储备液）。
3. 使用多聚-D-赖氨酸工作溶液包被培养容器表面（150 μL/cm²，即 48 孔板每孔使用 100 μL）。
4. 室温孵育培养容器 1 小时。
5. 移除多聚-D-赖氨酸溶液并用蒸馏水冲洗 3 次。确保彻底冲洗培养容器，因为过多的多聚-D-赖氨酸对细胞有毒性。
6. 将包被后的容器开口放于层流罩内直到孔完全干燥。您可以立即使用干燥平板，或使用 Parafilm 紧密包裹后在 4°C 下储存长达 1 周。

1. 在多聚-D-赖氨酸包被的 48 孔板或 8 室玻片中铺板约 1 × 10⁵ 个细胞/孔。通过添加 Neurobasal Plus 完全培养基，使细胞悬浮液体积达到 500 μL/孔。
   
2. 在含 5% CO₂、37°C 的湿润环境中孵育细胞。
   
3. 每三天换液一次，换液时从各孔吸出一半培养基，然后加入等量新鲜培养基。

制备多聚甲醛固定溶液

20% 多聚甲醛 (PFA) 储备液

1. 向 20 g EM 级多聚甲醛中加入 PBS，使总体积达到 100 mL。
   
2. 加入 0.25 mL 10 N NaOH，并在 60°C 下使用磁力搅拌器加热溶液，直至溶液完全溶解。
   
3. 通过 0.22 μm 过滤器过滤溶液，并在冰上进行冷却。请确保 pH 值为 7.5-8.0。
   
4. 将此溶液以 2 mL 为单位分装至 15 mL 试管中，在干冰上冷冻试管，并将它们储存于 -20°C 下。

用于固定的 4% PFA

1. 向含有 2 mL 20% PFA 的各 15 mL 试管中加入 8 mL PBS，在 37°C 水浴中解冻各试管。
   
2. 溶液一经溶解，就将试管置于冰上冷却。

细胞固定

1. 移除培养基并用含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 D-PBS 轻轻冲洗细胞两次，注意不要冲掉细胞。
   
2. 在室温下用新制备的 4% 多聚甲醛固定溶液 (PFA) 固定细胞 15 分钟。
   
3. 用含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 D-PBS 冲洗细胞三次。
   
4. 在室温下用 0.3% Triton®-X（在含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 D-PBS 中稀释）透化细胞 5 分钟。
   
5. 用含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 D-PBS 冲洗细胞三次。
   

细胞染色

1. 在 5% 山羊血清（用含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 D-PBS 稀释）中室温孵育细胞 60 分钟。
   
2. 移除 5% 山羊血清溶液，并在 5% 山羊血清稀释的一抗（10 μg/mL 小鼠抗 MAP2 和/或 4 μg/mL 兔抗 GFAP）中于 4°C 下孵育细胞过夜。确保细胞表面均匀覆盖抗体溶液。
   
3. 用含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 D-PBS 洗涤细胞三次，持续 5 分钟（如果使用的是玻片，可以使用染色皿和磁力搅拌器）。
   
4. 在 5% 山羊血清溶液稀释的荧光标记二抗（10 μg/mL Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 (H+L) 和/或 10 μg/mL Alexa Fluor 594 山羊抗兔 (H+L)）中室温孵育细胞 60 分钟。
   
5. 用含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 D-PBS 洗涤细胞三次。最后一次洗涤时，用 DAPI 溶液 (3 ng/mL) 对细胞进行 10 分钟的复染色。
   
6. 用 D-PBS 冲洗细胞，如有必要，每张玻片可以用 3 滴 ProLong Gold 抗淬灭试剂封片并用盖玻片封闭。您可将玻片避光储存于 4°C 下。
   
7. 使用 FITC、Cy5 和 DAPI 滤光片在显微镜下观察细胞。

在添加 2% B-27 Plus 补充剂的 Neurobasal 培养基中培养解冻的皮质神经元，显示 > 90% 的神经元细胞被 MAP2 抗体染色，以及极少量的星形胶质细胞被染色。在 3 到 4 天的培养过程中，神经元显示出大量的神经突生长，并且只要神经元保持健康则神经突将持续生长。需要注意的是如果在有血清的情况下培养神经元，则结果会有不同。

图 1.大鼠原代皮层神经元。使用小鼠抗 MAP2 抗体免疫荧光检测原代神经元细胞（绿色），使用兔抗 GFAP 标记检测星形胶质细胞（红色）。细胞核被 DAPI 染色（蓝色）。

上述程序设计用于在添加 2% B-27 Plus 补充剂的 Neurobasal 培养基中培养神经元细胞。使用其他培养体系和其他完全培养基配方产生的结果可能会不同，可能会产生更多数量的非神经元细胞（即星形胶质细胞）。

1. Brewer GJ, Price PJ (1996) Viable cultured neurons in ambient carbon dioxide and hibernation storage for a month.Neuroreport 7:1509–1512.
2. Brewer, G. J., Torricelli, J.R., Evege EK, Price PJ (1993) Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination.J Neurosci Res 35:567–576.