使用 Gibco PSC 神经诱导培养基诱导人多能干细胞中的神经干细胞

人多能干细胞 (PSC)（包括胚胎干细胞 (ESC) 和诱导型多能干细胞 (iPSC)）都是研究细胞结局规范、疾病建模和药物筛选的优秀资源。从 PSC 产生各种神经细胞的第一个重要步骤是将 PSC 诱导为神经干细胞 (NSC)。从人 PSC 衍生 NSC 的常规方法涉及拟胚体 (EB) 形成或与基质细胞系的共培养，具有几个缺点，包括耗时的方案和所得 NSC 质量的差异。我们开发了一种无血清神经诱导培养基，可在一周内将人 PSC 高效转化为 NSC，但无需费力的 EB 形成和 NSC 机械分离过程。

神经诱导培养基 (500 mL)

1.要制备 500 mL 完全 Gibco® 神经诱导培养基，请在无菌条件下混合以下组分：

• Neurobasal® 培养基 490 mL
• Gibco® 神经诱导补充剂 10 mL

2.完全神经诱导培养基可以在 2-8°C 的避光条件下储存最长 2 周。使用前，在 37°C 水浴中加热 Gibco® 神经诱导培养基 5-10 分钟。在 37°C 水浴中加热神经诱导培养基的时间不得超过 10 分钟，因为这可能会导致培养基降解。
注：Gibco® 神经诱导补充剂可以在 37°C 水浴中解冻 5 分钟或在 2-8°C 下过夜解冻，然后在 -5°C 至 -20°C 下等分并冷冻，可用于制备较小体积的完全培养基。避免重复解冻和冷冻神经诱导补充剂。

神经扩增培养基 (100 mL)

1.要制备 100 mL 完全神经扩增培养基，请在无菌条件下混合以下组分：

• Neurobasal® 培养基 49 mL
• Advanced™ DMEM⁄F-12 49 mL
• GIBCO® 神经诱导补充剂 2 mL

2.完全神经扩增培养基可以在 2-8°C 的避光条件下储存最长 2 周。使用前，在 37°C 水浴中加热神经扩增培养基 5-10 分钟。

ROCK 抑制剂 Y27632 溶液 (5 mM)

1.要制备 5 mM ROCK 抑制剂 Y27632 溶液，请在无菌条件下混合以下组分：

• Y27632 1 mg
• 蒸馏水 0.625 mL

2.溶解后，通过 0.22 μm 过滤器过滤，将 20-50 μL 等分试样置于无菌管中，可在 -5°C 至 -20°C 的避光条件下储存最长 1 年。解冻的 Y27632 溶液可在 2-8°C 下储存最长 1 周。
注：Y27632 的分子量为 320.26，不同批次之间可能因含水量不同而存在差异。

用 Geltrex® 经 hESC 验证的无 LDEV 基底膜基质包被培养容器

1.在 2-8°C 下过夜解冻一瓶 Geltrex® 经 hESC 验证的无 LDEV 低生长因子基底膜基质。
注：解冻的 Geltrex® 基质可在 -5°C 至 -20°C 下等分并冷冻，或在 2-8°C 下储存最长 2 周。避免重复解冻和冷冻。
2.要制备工作溶液，请在冰上使用冷 Neurobasal® 培养基按 1:100 的比例稀释解冻的 Geltrex® 基质溶液。
3.使用 Geltrex® 基质溶液快速覆盖每个培养容器的整个表面（参阅表 1）。
4.在 37°C、5% CO₂ 培养箱中孵育培养容器 1 小时。
5.现在可以使用培养容器。在临使用前，从培养容器中吸出稀释的 Geltrex® 溶液。细胞可直接铺到 Geltrex® 基质包被的培养容器上，无需冲洗。包被的培养容器也可在 2-8°C 下储存最长一周。储存时，使用 Parafilm® 实验室薄膜密封培养容器以防止干燥。使用前，在室温下将 2-8°C 下储存的包被培养容器预热 30 分钟。

方法快速链接

• 培养和制备人 PSC 以进行神经诱导
• 神经诱导
• P0 NSC 的收获和扩增
• NSC 的冻存
• 冻存 NSC 的复苏
• 多能性 (Oct4) 和 NSC（巢蛋白、Pax6、Sox1 和 Sox2）标记物的染色

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1.在神经诱导第 7 天（图 2C），NSC (P0) 可进行收获和扩增。
2.在进行后续步骤前，制备 Geltrex® 基质包被的容器。
3.用巴斯德玻璃吸管从待传代的 6 孔板中吸出消耗的神经诱导培养基。
4.将 2 mL DPBS（不含 CaCl₂ 和 MgCl₂）轻轻地添加至 6 孔板的各孔中，并吸出 DPBS 以冲洗细胞。
注：朝向孔壁添加 DPBS，以避免细胞分离。
5.将 1 mL 预热的 StemPro® Accutase® 细胞解离试剂添加至 6 孔板的各孔中，并在 37°C 下孵育 5-8 分钟，直至大多数细胞从培养容器的表面分离。
6.使用细胞刮棒将细胞从平板的表面分离下来。
7.使用 5 mL 移液器将细胞团块转移至 15 mL 或 50 mL 锥形管中。
8.将 1 mL DPBS 添加至 6 孔板的各孔中，以收集残留细胞，并将细胞悬浮液转移至锥形管中。
9.用 5 mL 或 10 mL 移液器轻轻地上下吹吸细胞悬浮液 3 次，以分散细胞团块。
10.将细胞悬浮液通过 100 μm 过滤器，并以 300 × g 离心细胞 4 分钟。
11.吸出上清液，用 DPBS（3-5 mL DPBS，用于 6 孔板的 1 个孔中的所有细胞）重悬细胞，并以 300 × g 离心细胞 4 分钟。
12.吸出上清液，用预热的完全神经扩增培养基（例如 1 mL，用于 6 孔板的 1 个孔中的所有细胞）重悬细胞。
13.使用您偏好的方法测定细胞浓度。
14.使用预热的完全神经扩增培养基将细胞悬浮液稀释至 2 × 10⁵-4 × 10⁵ 个细胞/mL。
15.将 ROCK 抑制剂 Y27632 添加至细胞悬浮液中，使得最终浓度为 5 μM。
16.从 Geltrex® 基质包被容器中吸出 Geltrex® 基质溶液，并将稀释的细胞悬浮液添加至各培养板/培养皿中，以 0.5 × 10⁵-1 × 10⁵ 个细胞/cm² 的密度对细胞进行铺板，如表 2 所示。

注：避免培养基溅到孔外侧，以避免污染。

18.过夜孵育后，更换为完全神经扩增培养基，以消除 ROCK 抑制剂 Y27632。此后，继续每隔一天更换神经扩增培养基（不含 Y27632）。
19.通常，NSC 在铺板后 4-6 天达到汇合（图 3A、B）。当 NSC 达到汇合时，可在完全神经扩增培养基中进一步扩增。扩增的 NSC 可以冻存（参见下面的方案）或按照您选择的方案分化为特定的神经细胞类型。

注：P0-P4 NSC 解离后，在铺板时需要使用最终浓度为 5 μM 的 ROCK 抑制剂 Y27632 进行过夜处理，以防止扩增和分化为神经胶质细胞和神经元细胞时的细胞死亡（图 3C）。

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1.确保您的 NSC 在冻存前已至少传代至 P1。
2.当 NSC 达到汇合时，按照表 3，在 37°C 水浴中加热适量的 StemPro® Accutase® 试剂。

1.按之前所述制备 Geltrex® 基质包被培养皿。
2.佩戴护目用具，因为储存在液氮液相中的冻存管在加热时可能会意外爆炸。
3.佩戴超低温手套。使用金属镊子从液氮储罐中取出 NSC 冷冻管。
4.将冻存管浸入 37°C 水浴中，不要浸没管盖。轻轻旋转冻存管。
5.当仅残留冰晶时，从水浴中取出冻存管。
6.在冻存管表面喷洒 70% 乙醇，并将其放入细胞培养通风柜中。
7.使用 1 mL 移液器将细胞轻轻移取至 15 mL 无菌锥形管中。
8.将 1 mL DPBS 添加至冻存管中，以收集常驻细胞。从冻存管中移出 DPBS，并将其逐滴添加至 15 mL 锥形管中。添加时，轻轻地来回移动锥形管以混合 NSC。这可减少细胞的渗透休克。
9.以 300 × g 离心细胞 5 分钟，并吸出上清液。
10.将细胞沉淀重悬于 DPBS 中。以 300 × g 离心 5 分钟，并吸出上清液。
11.在适量（例如 1 mL，用于 1 个冻存管的所有 NSC）预热的神经扩增培养基中重悬细胞沉淀。
12.使用您偏好的方法测定细胞浓度。
13.使用预热的神经扩增培养基将细胞悬浮液稀释至溶液中（含 2 × 10⁵-4 × 10⁵ 个细胞/mL）。

注：如果 NSC 在第 4 次传代前进行冻存，则需要将最终浓度为 5 μM 的 ROCK 抑制剂 Y27632 溶液添加至细胞悬浮液中，以防止细胞死亡。

14.从 Geltrex® 基质包被容器中吸出 Geltrex® 基质溶液，并将适量稀释的细胞悬浮液添加至各培养容器中，以 0.5 × 10⁵-1 × 10⁵个细胞/cm2 的密度对细胞进行铺板（参见表 4）。

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下表列举了进行神经诱导实验时的一些潜在问题，以及可帮助排除故障的解决方案。

LT177             出版物编号 MAN0008031    修订版 1