从神经干细胞中分离 RNA 和制备 cDNA

一种用于鉴别神经干细胞 (NSC) 及其亚谱系的快速分析方法，涉及在 RNA 水平跟踪的分化标记的早期检测。该方案遵循 PureLink™ RNA 小提试剂盒手册中所述的方法，从神经干细胞 (NSC) 中分离总 RNA，然后使用 Superscript® III 逆转录酶合成 cDNA。以下方案为您提供了制备 RT-PCR 或 qPCR 所需模板的分步程序。

分离 RNA

重要提示：除非另有说明，否则在冰上执行所有步骤。对于所有孵育，均应提前加热热循环仪。临使用前预冷所有试剂并解冻所有冷冻试剂和细胞。使用带气溶胶屏障的不含 RNase 的移液器吸头。

1. 通过在每 mL RNA 裂解液中加入 10 μL β-巯基乙醇，制备 RNA 裂解液。
2. 从 T-25 培养瓶中取出培养基，用 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (D-PBS) 冲洗一次，并在 37°C 用 1 mL 预热 TrypLE™ 试剂处理细胞 10 分钟。
3. 收获细胞并将其放入 15 mL 离心管中。取 100 μL 样本，获得活细胞计数。
4. 在台式离心机中以 100 × g 离心细胞 7 分钟。弃去上清液。
5. 在 -70°C 冷冻冰箱中过夜冷冻细胞。
6. 使细胞沉淀解冻。在收获的每个 T-25 培养瓶中添加 0.5 mL RNA 裂解液用于沉淀（0.5 mL/2 × 10⁶-5 × 10⁶ 个细胞）。吹吸细胞约 20 次，直至沉淀被分散。
7. 将 0.5 mL 细胞裂解液转移至 1.5 mL 不含 RNase 的微量离心管中，并在室温下以 12,000 × g (12,000 rpm) 离心 2 分钟。
8. 向各管中加入 0.5 mL 70% 乙醇，涡旋混悬液 5-10 次。
9. 从样本中取 600 μL 等份试液加入 RNA 离心柱中。在室温下以 12,000 × g 离心 15-30 秒，然后弃去流过物。继续取同一 RNA 样本的 600 μL 等份试液加入离心柱，直至处理完整个样本。
10. 向离心柱中加入 700 μL 洗涤缓冲液 I，在室温下以 12,000 × g 离心 15-30 秒。弃去流过物和管。将离心柱放入一个干净的 2 mL RNA 洗涤管中。
11. 向离心柱中加入 500 μL 洗涤缓冲液 II（含乙醇），在室温下以 12,000 × g 离心 15-30 秒。弃去流过物。离心 1 分钟以干燥离心柱。
12. 将离心柱放入一个 RNA 回收管中。向离心柱中加入 40 μL 不含 RNase 的水，静置 1 分钟。在室温下以 12,000 × g 将离心柱离心 2 分钟。再向离心柱中加入 40 μL 不含 RNase 的水，并重复该步骤。得率应约为 60-300 μg 总 RNA。

注：务必留出时间使不含 RNase 的水渗入离心柱床。请勿立即对离心柱进行离心，因为这可能导致不完全回收并改变 RNA 得率。要回收更多 RNA，再向离心柱中加入 40 μL 不含 RNase 的水，并第三次重复最后一步。

测定 RNA 质量

1. 使用 NanoDrop™ 分光光度计分析 1 μL RNA 样本，测量 260 nm 和 280 nm 处的吸光度比。读数三次，取平均值作为最终值。测量每份 RNA 样本前后，用一块被 DEPC 水浸湿的实验室纸巾将分析台擦拭干净。纯 RNA 的 A_260/280 约为 2。注：分离的 RNA 的得率和质量取决于起始材料的类型和陈置时间以及材料的收集和保存方式。
2. 按以下步骤制备用于 RNA 凝胶分析的 RNA 样本：
   
   

   组分	用量
   RNA 样本	1 μL
   2X BlueJuice™ 凝胶上样缓冲液	1 μL
   经 DEPC 处理的水	8 μL

3. 混合各组分，并将样本上样至琼脂糖凝胶的各孔中。使用 10 μL 0.1 kb 和 1 kb 分子量标记物来估算核糖体 RNA 条带的分子量大小。在空孔中加入 10 μL DEPC 水。样本跑胶 30 分钟，在紫外光灯箱中使条带可视化，捕获凝胶图像，并进行条带强度测量。

RNA 储存

RNA 样本在 -70°C 下储存或对其进行进一步处理以用于 cDNA 合成。

第一链 cDNA 合成

此方案遵循 Superscript® III 第一链合成 SuperMix 的说明中所述的方法。

1. 在使用前将各组分混匀并短暂离心。热循环仪预热至 65°C。
2. 在冰上将以下组分混合于 0.2 mL 薄壁 PCR 管中。使用含最多 1 μg 总 RNA 的体积进行反应。
   
   

   组分	用量
   退火缓冲液	1 μL
   随机六聚体 (50 ng/μL)	1 μL
   RNA (1 μg)	x μL
   经 DEPC 处理的水	加至 8 μL

3. 在热循环仪中于 65°C 下孵育反应物 5 分钟，然后立即置于冰上至少 1 分钟。通过短暂离心收集管内容物。
4. 管置于冰上时，向管中加入以下组分：
   
   
   

   组分	用量
   2X 第一链反应混合物	10 μL
   SuperScript® III/RNaseOUT™ 酶混合物	2 μL

5. 短暂涡旋样本，并通过短暂离心收集内容物。
6. 在 25°C 下孵育管 10 分钟。
7. 在 42°C 下孵育管 50 分钟。
8. 通过 85°C 孵育 5 分钟终止反应，然后在冰上冷却管。
9. 向样本中加入 1 μL RNase H，37°C 孵育 20 分钟。
10. cDNA 样本在 -20°C 下储存。