Cryopreserving Neural Stem Cells

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介绍

有许多方案可用于冻存源于人胚胎干细胞的神经干细胞 (NSC)；这些方法的主要目的是在解冻后复苏细胞并保留其多能特性。本页描述了一种标准化的冻存方案，该方案不会改变保存细胞的活力和亚谱系分化能力。

所需材料

细胞

神经干细胞 (NSC)

培养基和试剂

  • KnockOut™ D-MEM/F-12（货号 12660）
  • StemPro® NSC SFM（货号 A10509-01）
  • 重组人碱性 FGF (bFGF) (AA 10–155)（货号 PHG0024）
  • 重组人 EGF（货号 PHG0314）
  • TrypLE™ Select (1X)（货号 12563-029）
  • Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (D-PBS)（货号 14190-144）
  • DMSO（二甲基亚砜）（Sigma，货号 D2650）

工具和设备

  • 15 mL 无菌锥形管
  • 台式离心机
  • 针头过滤器
  • 冻存管
  • Cryo 1°C 梯度降温盒（Nalgene，货号 5100-0001）

制备培养基

StemPro® NSC SFM 完全培养基

StemPro® NSC SFM 完全培养基包括 KnockOut™ D-MEM/F-12 以及 StemPro® 神经补充剂、EGF、bFGF 和 GlutaMAX™-I。在 2-8°C 下避光储存时，完全培养基可稳定放置 4 周。

要制备 50 mL StemPro® NSC SFM 完全培养基，请在无菌条件下混合以下组分。如需使用更大体积，请按比例增加组分用量。如需要，在 50 mL 完全培养基中加入 0.5 mL 真菌-抗生素溶液。

组分最终浓度用量
KnockOut™ D-MEM/F-121X48.5 mL
GlutaMAX™-I 补充剂2 mM0.5 mL
bFGF20 ng/mL1 μg
EGF20 ng/mL1 μg
StemPro® 神经补充剂2%1 mL


冻存培养基

要制备 10 mL 冻存培养基，请在无菌条件下混合以下组分。如需使用更大体积，请按比例增加组分用量。对冻存培养基进行过滤除菌，使用前在 2-8°C 下储存。您可能在解冻 StemPro® 神经补充剂的过程中发现白色沉淀；完全解冻或溶解后该沉淀将消失。


组分最终浓度用量
不含 bFGF 和 EGF 的 StemPro® NSC SFM 完全培养基
（参见上文）		90%9 mL
DMSO10%1 mL

冻存神经干细胞

冻存神经干细胞指南

  • 当 NSC 汇合度为 80%-90% 时（接种后 2-4 天），冻存 NSC。
  • 以 2 × 106-2.4 × 106 个活细胞/mL 的浓度冷冻 NSC，体积为 1 mL/管。
  • 使用由不含生长因子（即 bFGF 和 EGF）的 90% 完全 StemPro® NSC SFM 和 10% DMSO 组成的冻存培养基。
  • 在 TrypLE™ Select 中孵育 NSC 不得超过 2 分钟，以避免细胞死亡。
  • 预先在所有冻存管上标记以下信息：细胞系、传代数、浓度、冷冻日期和您的姓名首字母缩写。

冷冻神经干细胞

  1. 当 NSC 汇合度为 80%-90% 时（接种后 2-4 天），吸出培养容器中的完全 StemPro® NSC SFM。
  2. 使用 D-PBS 洗涤细胞两次。吸出并弃去 D-PBS。
  3. 向培养容器中加入 1 mL 预热的 TrypLE™ Select，并在 37°C 下孵育 2 分钟。注：在 TrypLE™ Select 中孵育 NSC 不得超过 2 分钟，以避免细胞死亡。通过在孵育期后立即添加完全 StemPro® NSC SFM 来中和 TrypLE™ Select（参见下文）。
  4. 通过用移液器吹掉细胞或用手掌轻敲培养容器，分离 NSC 与培养容器。
  5. 通过添加 5 mL 完全 StemPro® NSC SFM 终止 TrypLE™ Select 处理。
  6. 轻轻上下吹吸 NSC，得到单细胞悬浮液，并将细胞悬浮液转移至无菌 15 mL 锥形管中。
  7. 以 200 × g 离心 NSC 5 分钟。吸出并弃去上清液。
  8. 将细胞沉淀重悬于最小体积的预热完全 StemPro® NSC SFM 中，并取出样本进行计数。
  9. 使用您所选的方法确定细胞总数。
  10. 从锥形管中轻轻吸出培养基，逐滴添加预冷的 (4°C) 冻存培养基，并重悬细胞，使得浓度为 2 × 106-2.4 × 106 个活细胞/mL。
  11. 将冻存培养基中 1 mL NSC 悬浮液转移至各预标记的预冷 (4°C) 冻存管中。
  12. 将冻存管转移至 Cryo 1°C 梯度降温盒中，并将容器放入 -80°C 冷冻冰箱中。该程序可确保细胞缓慢冷冻。
  13. 第二天，将细胞转移至液氮中。
LT146                    2011 年 3 月 17 日