多巴胺能神经元的衍生（来自人胚胎干细胞）

特定谱系的定向分化一直是人胚胎干细胞 (hESC) 研究领域的焦点。使用 hESC 进行的细胞替代治疗有望治疗帕金森病和其他神经退行性疾病。本章介绍了从 hESC 衍生多巴胺 (DA) 神经元的程序。

所需材料

细胞

• Gibco 小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF)，经辐照（货号 S1520-100）
• 人胚胎干细胞 (hESC)

培养基和试剂

• Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (D-PBS)，不含 Ca2+ 和 Mg2+（货号 14190）
• 含 GlutaMAX-I 的 D-MEM/F-12（货号 10565-018）
• Neurobasal 培养基（货号 21103-049）
• Knockout 血清替代物（货号 10828-028）
• 10% 牛血清白蛋白 (BSA)（货号 P2489）
• 胎牛血清 (FBS)（货号 16000-044）
• Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (D-MEM)（货号 10569-010）
• 非必需氨基酸溶液 (NEAA)（货号 11140）
• B-27 补充剂，不含维生素 A（货号 12587-010）
• N-2 补充剂（货号 17502-048）
• β-巯基乙醇（货号 21985-023）
• 附着因子（货号 S-006-100）
• 天然小鼠层黏连蛋白（货号 23017-015）
• StemPro Accutase 细胞解离试剂（货号 A11105-01）
• 重组人碱性 FGF (bFGF)（货号 13256-029）
• 重组人 FGF-8b（货号 PHG0271）
• 重组人 B-DNF（货号 PHC7074）
• 重组人 G-DNF（货号 PHC7045）
• 台盼蓝染色剂（货号 15250-061）
• 蒸馏水（货号 15230-162）
• 多聚-L-鸟氨酸（Sigma，货号 P3655）
• 肝素（Sigma，货号 H3149）
• 抗坏血酸（Sigma，货号 A4403）
• 二丁酰环 AMP (dcAMP)（Sigma，货号 D0627）
• 重组人 Sonic Hedgehog (SHH)（R&D systems，货号 1314-SH-025）

专用工具

• StemPro EZPassage 一次性干细胞传代工具（货号 23181-010）
• 细胞刮棒（Fisher，货号 087711A）

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储备液

Knockout 血清替代物 (KSR)

解冻一瓶 KSR，制备 50 mL 等份试液，储存于 -20°C。在解冻后一周内使用 KSR。

重组人碱性 FGF

在含 0.1% BSA 的 D-PBS 中制备 10 μg/mL 储备液，分装到无菌试管中，储存于 -20°C。

肝素

在 D-PBS 中制备 2 mg/mL 储备液，按 0.5 mL 的体积分装到无菌试管中，储存于 -80°C。

抗坏血酸

在 D-PBS 中制备 200 mM 储备液，按 0.5 mL 的体积分装到无菌试管中，储存于 -20°C。

重组人 Sonic Hedgehog

在含 0.1% BSA 的 D-PBS 中制备 0.2 mg/mL 储备液，分装到无菌试管中，储存于 -20°C。

重组人 FGF8b

在含 0.1% BSA 的 D-PBS 中制备 0.1 mg/mL 储备液，分装到无菌试管中，储存于 -20°C。

重组人 BDNF

在含 0.1% BSA 的 D-PBS 中制备 25 μg/mL 储备液，分装到无菌试管中，储存于 -20°C。

重组人 GDNF

在含 0.1% BSA 的 D-PBS 中制备 20 μg/mL 储备液，分装到无菌试管中，储存于 -20°C。

二丁酰环 AMP (dcAMP)

在蒸馏水中制备 1 mM 储备液，按 0.5 mL 的体积分装到无菌试管中，储存于 -20°C。

多聚-L-鸟氨酸

在蒸馏水中制备 10 mg/mL 储备液，按 0.5 mL 的体积分装到无菌试管中，储存于 -20°C。

小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 培养基

要制备 100 mL MEF 培养基，请在无菌条件下混合以下组分。如需使用更大体积，请按比例增加组分用量。

人胚胎干细胞 (hESC) 培养基

要制备 100 mL hESC 培养基，请在无菌条件下混合以下组分。如需使用更大体积，请按比例增加组分用量。hESC 培养基在 4°C 下最长保存 7 天。

神经诱导培养基

要制备 100 mL 神经诱导培养基，请在无菌条件下混合以下组分。如需使用更大体积，请按比例增加组分用量。神经诱导培养基在 4°C 下最长保存 7 天。

神经扩增培养基

要制备 100 mL 神经扩增培养基，请在无菌条件下混合以下组分。如需使用更大体积，请按比例增加组分用量。神经扩增培养基在 4°C 下最长保存 7 天。

DA 神经元分化培养基

要制备 100 mL DA 神经分化培养基，请在无菌条件下混合以下组分。如需使用更大体积，请按比例增加组分用量。DA 神经分化培养基在 4°C 下最长保存 7 天。

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明胶包被培养容器

1. 用附着因子溶液覆盖每个培养容器的全部表面（6 孔板的各孔需要 1 mL、每个 60 mm 培养皿需要 2 mL 或每个 100 培养皿需要 4 mL），室温孵育 1 小时。使用蒸馏水洗涤一次，然后对 MEF 进行铺板。

注：AF 是含有 0.1% 明胶的无菌 1X 溶液，可从 Invitrogen 购买。

MEF 解冻

1. 佩戴护目镜和超低温防护手套，使用金属镊子从液氮储罐中取出经辐照 MEF 冻存管。注：如果冻存管在取出和步骤 3 之间暴露于环境温度的时间超过 15 秒，则将冻存管转移到具有少量液氮的容器中。
2. 将含有 MEF 的冻存管置于双手间短暂滚动约 10-15 秒以去除霜冻，然后置于 37°C 水浴中轻轻旋转。请勿完全浸没冻存管。
3. 当冻存管中仅剩余少量冰时，将其从水浴中取出。在冻存管表面喷洒 70% 乙醇，然后将其放入细胞培养通风柜中。
4. 使用 1 mL 移液器将解冻的细胞轻轻吸移到 15 mL 锥形管中。
5. 用 1 mL 预热的 MEF 培养基冲洗冻存管。将培养基转移到含有细胞的相同 15 mL 试管中。
6. 向细胞中逐滴加入 4 mL 预热的 MEF 培养基。通过上下吹吸轻轻混匀。注：缓慢添加培养基有助于细胞避免渗透休克。
7. 以 200 × g 离心细胞 5 分钟。
8. 吸出上清液，并将细胞沉淀重悬于 5 mL 预热的 MEF 培养基中。
9. 吸取 10 μL 细胞悬浮液，并使用您选择的方法测定活细胞计数。

注：我们建议使用 Countess 自动细胞计数仪进行轻松准确的细胞计数和活力测定。

MEF 铺板

1. 以 200 × g 离心 MEF 5 分钟，并吸出上清液。
2. 将细胞沉淀重悬于 MEF 培养基中，使浓度达到 2.5 × 10⁶ 个细胞/mL。
3. 从包被的培养容器中吸出附着因子溶液，用 D-PBS 洗涤平板一次。
4. 向各培养容器中加入适量 MEF 培养基（6 孔板的各孔加入 2.5 mL、每个 60 mm 培养皿加入 5 mL 或每个 100 培养皿加入 10 mL）。
5. 向上述各培养容器中加入适量 MEF 悬浮液（6 孔板的各孔加入 0.1 mL、每个 60 mm 培养皿加入 0.2 mL 或每个 100 培养皿加入 0.6 mL）。GIBCO 小鼠胚胎成纤维细胞（经辐照）的建议铺板密度为 2.5 × 10⁴ 个细胞/cm²。
6. 前后左右快速移动培养容器数次，使细胞分散在孔和培养皿的表面。细胞铺板后，将容器置于含 5% CO₂、37°C 的湿润培养箱中。在铺板后 3-4 天内使用 MEF 平板和培养皿。

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1. 佩戴护目镜和超低温防护手套，使用金属镊子从液氮储罐中取出一管 hESC。
2. 将冻存管浸入 37°C 水浴中，不要浸没管盖。轻轻旋转冻存管。
3. 当冻存管中仅剩余少量冰时，将其从水浴中取出。在冻存管表面喷洒 70% 乙醇，然后将其放入细胞培养通风柜中。
4. 使用 1 mL 移液器将细胞轻轻转移到 15 mL 锥形管中。用 1 mL 预热的 hESC 培养基冲洗冻存管，收集管中剩余的细胞，并将它们逐滴加入 15 mL 锥形管中。注：缓慢添加培养基有助于细胞避免渗透休克。
5. 在 15 mL 锥形管中逐滴加入 4 mL 预热的 hESC 培养基。加入培养基的同时，轻轻地来回移动试管以混合 hESC。
6. 以 200 × g 离心细胞 5 分钟。
7. 吸出上清液，并将细胞沉淀重悬于 5 mL 预热的 hESC 培养基中。
8. 在含有失活 MEF 的培养容器上标记从冻存管取出的 hESC 的传代数、日期和您的姓名首字母缩写。
9. 从含有 MEF 的培养容器中吸出 MEF 培养基，并轻轻地将重悬 hESC 加入容器中。
10. 前后左右快速移动培养容器数次，使细胞分散在容器的表面。将容器轻轻置于含 5% CO₂、37°C 的湿润培养箱中。
11. 每天更换消耗的培养基，并在显微镜下检查细胞状态。如果在多个容器中饲养细胞，则对每个容器使用不同的移液器，以降低污染风险。注：在最初几天可能观察不到 hESC 集落。
12. 每天观察 hESC，并在集落太大或太密集时进行细胞传代。传代比率取决于培养容器中的 hESC 总数（第一次复苏时 hESC 的传代比率约为 1:2 至 1:4）。

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通用指南

• 通常，当发生以下第一例事件时，进行细胞传代：
  • MEF 饲养层已使用两周。
  • hESC 集落太密集或太大。
  • 分化增加。
• 传代比率会有所不同，但通常介于 1:4 和 1:6 之间。
• 偶尔 hESC 会以不同的速率生长，需要调整传代比率。一般规则是记录上一次传代比率，并根据 hESC 集落的外观调整比率。
• 如果细胞看起来健康，且集落有足够的空间，则使用
• 与上一次传代相同的比率。如果细胞过于密集和拥挤，则增加
• 传代比率；如果细胞稀疏，则降低比率。
• 通常，根据外观，需要每 4-10 天对 hESC 进行一次传代。

hESC 传代

1. 在对 hESC 培养物进行传代前两天，准备新的 MEF 培养容器。
2. 从培养箱中取出含有 hESC 的培养容器。在显微镜下使用显微镜标记对分化的集落进行标记，并在培养通风柜中使用巴斯德吸管将其吸出。
3. 向每个培养容器中加入适量预热的 hESC 培养基（每个 60 mm 培养皿加入 2 mL 或每个 100 mL 培养皿加入 4 mL）。
4. 在整个容器内沿一个方向（从左到右）滚动 StemPro® EZPassage™ 一次性干细胞传代工具。将培养容器旋转 90 度，再次在整个容器内滚动工具。
5. 使用细胞刮棒，轻轻地将细胞从培养容器表面分离。使用 5 mL 移液器，将细胞团块轻轻转移到 15 mL 或 50 mL 锥形管中。
6. 使用适量预热的 hESC 培养基（每个 60 mm 培养皿使用 1 mL 或每个 100 mm 培养皿使用 2 mL）冲洗培养容器，以收集剩余的细胞。
7. 如果一些细胞团块太大，使用 5 mL 移液器上下吹吸细胞溶液数次，从而将细胞团块分解成更小的团块。
8. 从每个 MEF 培养容器中吸出 MEF 培养基，并将其更换为适量预热的 hESC 培养基（每个 60 mm 培养皿加入 5 mL 或每个 100 mm 培养皿加入 10 mL）。
9. 轻轻振摇含有 hESC 的锥形管，使细胞团块均匀分布，并将适量 hESC 悬浮液添加到各 MEF 培养容器中。注：每个培养皿中加入的 hESC 悬浮液的体积取决于传代比率（参见上述“通用指南”）。
10. 前后左右快速移动培养容器数次，使 hESC 分散在容器的表面。将培养容器轻轻置于含 5% CO₂、37°C 的湿润培养箱中。
11. 每天更换消耗的培养基。根据外观，需要每 4-10 天对 hESC 进行一次传代。

制备拟胚体 (EB)

1. 在 MEF 饲养层细胞上培养 hESC，直至其汇合度达到 90%-100%。
2. 在整个容器内沿一个方向（从左到右）滚动 StemPro® EZPassage™ 一次性干细胞传代工具。将培养容器旋转 90 度，再次在整个容器内滚动工具。
3. 使用细胞刮棒，轻轻地将细胞从培养容器表面分离。使用 5 mL 移液器，将细胞团块轻轻转移到 50 mL 锥形管中。
   注：请勿将细胞团块分解成更小的团块。
4. 向 6 孔板的每个孔中加入 1 mL 预热的 hESC EB 培养基，向每个 60 mm 培养皿中加入 2 mL 培养基或向每个 100 mm 培养皿中加入 3 mL 培养基，收集剩余的细胞，并将它们加入含有 hESC 的 50 mL 锥形管中。
5. 以 200 × g 离心细胞 5 分钟。
6. 从 hESC 沉淀吸出上清液。使用适量 EB 培养基轻轻重悬沉淀（一个 60 mm 培养皿中的所有细胞使用 15 mL 或一个 100 mm 培养皿中的所有细胞使用 40 mL）。
7. 将细胞团块转移到未包被的 T-75 培养瓶中孵育数小时。这使得成纤维细胞能够以不同的方式附着到培养瓶上。
8. 数小时后，以一定角度向下倾斜 T-75 培养瓶，使 EB 聚集在培养瓶的一角。吸出 EB 培养基，并替换为 40 mL 新鲜 EB 培养基。将细胞团块转移到新的 T-75 培养瓶中，并在含 5% CO₂、37°C 的湿润培养箱中孵育。
9. 使用 EB 培养基每天为 EB 换液，持续 4 天。换液时，以一定角度向下倾斜培养瓶，使 EB 聚集在培养瓶的一角。吸出几乎全部消耗的 EB 培养基，替换为预热的 EB 培养基，并将培养瓶放回培养箱。
   注：由于死细胞释放 DNA，细胞团块可能会粘连在一起。在这种情况下，使用 5 mL 移液器轻轻地将 EB 上下吹吸 2-3 次。这将有助于清除 EB 表面的死细胞。如果 EB 附着在培养瓶上，则使用 5 mL 移液器将附着的 EB 吹离培养瓶底部。

分化 EB（玫瑰花结形成）和中脑详细说明

1. 在 EB 培养基中培养 EB 4 天后，将 EB 从 T-75 培养瓶转移到 50 mL 离心管中，并以 200 × g 的转速离心 3 分钟。
2. 吸出 EB 培养基并将 EB 重悬于 10 mL 预热的神经诱导培养基中。
3. 以 200 × g 离心 EB 3 分钟。
4. 吸出上清液，并将 EB 重悬于 40 mL 预热的神经诱导培养基中。将 EB 转移至新的 T-75 培养瓶中，并在含 5% CO₂、37°C 的湿润培养箱中于神经诱导培养基中孵育 EB 2 天。EB 在神经诱导培养基中悬浮培养 2 天后，即可进行分化。注：如果 EB 附着在培养瓶上，则使用 5 mL 移液器将附着的 EB 吹离培养瓶底部。
5. 用 D-PBS 将层黏连蛋白稀释至 20 μg/mL，使用 2.5-3 mL 层黏连蛋白包被一个 100 mm 培养皿，共包被 10 个培养皿。在 37°C 培养箱中孵育层黏连蛋白包被培养皿数小时。注：层黏连蛋白解冻过快时可能会形成凝胶。为了避免这种情况，在寒冷 (2°C-8°C) 环境中缓慢解冻。解冻后，分装至聚丙烯管中，并储存于 -5°C 至 -20°C。切勿反复冻融层黏连蛋白。
6. 孵育后，吸出层黏连蛋白，并向每个 100 mm 培养皿中加入 10 mL 预热的神经诱导培养基。
7. 将 T-75 培养瓶中的 EB 转移至 50 mL 试管中，并以 200 × g 离心 3 分钟。
8. 吸出上清液，并将 EB 重悬于 10 mL 预热的神经诱导培养基中。
9. 轻轻振摇含有 EB 的 50 mL 试管，使 EB 均匀分布，并将 1 mL EB 悬浮液添加到各个层黏连蛋白包被的培养皿中。
10. 前后左右快速移动培养皿数次，使 EB 分散在培养皿的表面。将培养皿轻轻置于含 5% CO₂、37°C 的湿润培养箱中。
11. 使用新鲜的预热神经诱导培养基每隔一天为 EB 进行一次换液，直到早期玫瑰花结形成（约 2-3 天）。
12. 要使神经前体定向分化成中脑，使用含有 100 ng/mL FGF-8b 和 200 ng/mL Sonic Hedgehog (SHH) 的神经诱导培养基每隔一天为分化的 EB 进行一次换液，持续 5-6 天。注：以 200-250 的密度将 EB 铺到每个 100 mm 培养皿中。通常，在一个 100 mm 培养皿中培养的 hESC 得到的所有 EB 可铺到 8 至 10 个 100 mm 培养皿中。由于 hESC 汇合度和 EB 形成效率的不同可能有所差异

分离 DA 祖细胞

1. 使用显微镜标记对含有玫瑰花结的所有分化集落进行标记。
2. 使用 200 μL 移液器吸头对准每个标记集落的中心，然后吹掉玫瑰花结中的细胞。
3. 使用 10 mL 移液器将分离的细胞团块转移至 50 mL 离心管中。
   注：您可以将 5 个 100 mm 培养皿中的细胞团块合并到一个 50 mL 试管中。
4. 以 200 × g 离心细胞 3 分钟。
5. 吸出上清液，并将细胞团块重悬于 40 mL 含有 100 ng/mL FGF-8b 和 200 ng/mL SHH 的神经扩增培养基中。
6. 将细胞团块转移到 T-75 培养瓶中，并将培养瓶置于含 5% CO₂、37°C 的湿润培养箱中。在培养箱中培养约 1 天后，玫瑰花结会卷起形成神经球。
7. 每隔一天将含有 100 ng/mL FGF-8b 和 200 ng/mL SHH 的神经扩增培养基的一半替换为新鲜培养基。
   注：污染的非神经细胞往往会附着在培养瓶上。更换培养基时，以一定角度向下倾斜培养瓶，使神经球聚集在培养瓶的一角。吸出一半的神经扩增培养基，并使用 10 mL 移液器将神经球与剩余的消耗神经扩增培养基转移至新的 T-75 培养瓶中。向培养瓶中加入 20 mL 预热的新鲜神经扩增培养基，并在含 5% CO₂、37°C 的湿润培养箱中孵育。您可以重复该程序数次以纯化神经细胞。

DA 神经元分化

1. 使用溶于蒸馏水的 20 μg/mL 多聚-L-鸟氨酸工作溶液（T-75：14 mL，T-25：7 mL，60 mm 培养皿：3.5 mL，35 mm 培养皿：2 mL）包被培养容器表面（含或不含盖玻片），并在室温下过夜孵育容器。
2. 用蒸馏水洗涤多聚-L-鸟氨酸包被的容器 4 次，然后用溶于 D-PBS 且不含钙或镁的 10 μg/mL 层黏连蛋白工作溶液（T-75：14 mL，T-25：7 mL，60 mm 培养皿：3.5 mL，35 mm 培养皿：2 mL）包被。在 37°C 下孵育培养容器 3 小时。 
   注：您可以提前包被培养容器，使用不含钙或镁的 D-PBS 替换层黏连蛋白溶液，并用 Parafilm 紧密包裹储存长达 1 周。确保培养容器不会变干。
3. 神经球在神经扩增培养基中悬浮培养 6-8 天后，将其转移至 15 mL 试管中，并以 200 × g 离心 5 分钟。
4. 吸出上清液，并于 37°C 下在预热的 StemPro® Accutase® 细胞解离试剂中孵育神经球 10 分钟。
5. 轻轻上下吹吸细胞团块，将较大的团块分解成单细胞悬浮液。
6. 以 200 × g 离心细胞 5 分钟，并吸出上清液。
7. 将细胞重悬于 10 mL 预热的神经分化培养基中。
8. 重复步骤 6 和步骤 7。
9. 从包被的培养容器中吸出层黏连蛋白并对解离的 DA 祖细胞进行铺板。
10. 在含 5% CO₂、37°C 的湿润培养箱中孵育细胞，然后每隔一天用新鲜的神经分化培养基替换消耗的培养基。
11. 您可以在铺板后 3-4 周评估 DA 神经元分化情况。