Derivation and Culture of Dopaminergic Neurons (from Midbrains of Rodents)

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介绍

 

多巴胺能 (DA) 神经元位于中脑腹侧 (VM) 中。从 VM 中分离前体细胞和神经元的能力为表征其分化特性和研究其恢复帕金森病 (PD) 中变性多巴胺神经元的潜力提供了一种强有力的手段。本章描述了将来源于胚胎腹侧中脑的前体细胞分化为 DA 神经元的方法。
 
该程序改编自 Pruszak 等人，2009，并获得干细胞生物学现行方案的许可。
 
所需材料

胚胎

  • 大鼠 (E14) 胚胎或小鼠 (E13) 胚胎

培养基和试剂

  • 蒸馏水（货号 15230-162）
  • 不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 Hanks 平衡盐溶液 (HBSS)（货号 14170-112）
  • 不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (D-PBS)（货号 14190）
  • D-葡萄糖（Sigma，货号 G8270）
  • 青霉素-链霉素（货号 15070-063）
  • 抗坏血酸（Sigma，货号 A4034）
  • StemPro Accutase 细胞解离试剂（货号 A11105-01）
  • 台盼蓝（货号 15250-061）
  • 天然小鼠层黏连蛋白（货号 23017-015）
  • 多聚-L-鸟氨酸（Sigma，货号 P4957）
  • L-谷氨酰胺（货号 25030-081）
  • Neurobasal 培养基（货号 21103-049）
  • B-27 无血清补充剂（货号 17504-044）
  • B-27 Plus 补充剂（货号 A3582801）
  • 热灭活胎牛血清 (FBS)（货号 10438）

专用工具

  • 显微解剖仪器（灭菌）
    • 微型解剖剪
    • 中型解剖剪
    • Dumont 镊子，直形
    • Dumont 镊子，弯角或曲面
    • 曲面显微解剖剪
    • 刮铲、带孔的 Moria 穿孔勺子（例如，Moria MC17）
  • 解剖显微镜（例如，徕卡 MZ6 或蔡司 Stemi 2000）
  • 曲面解剖刀刀片（例如，BD Bard-Parker 编号 23 或 24）

制备试剂

多聚-L-鸟氨酸储备液

在蒸馏水中制备 10 mg/mL 多聚-L-鸟氨酸储备液。使用 0.22 μm 过滤器进行过滤除菌，并在 -20°C 下储存长达 12 个月。

抗坏血酸储备液

在 D-PBS 中制备 200 mM 抗坏血酸储备液。使用 0.22 μm 过滤器进行过滤除菌。在 -20°C 下避光储存长达 12 个月。

解剖缓冲液

对于 100 mL 解剖缓冲液，在无菌条件下混合下列组分。缓冲液可在 4°C 下储存 1 周。使用前添加抗坏血酸溶液。

组分用量
HBSS98 mL
D-葡萄糖360.3 mg
青霉素/链霉素2 mL
抗坏血酸溶液0.1 mL

制备培养基

分化培养基

对于 100 mL 分化培养基，在无菌条件下混合以下组分。此培养基可以在 4°C 下储存 1 周，并在使用前添加抗坏血酸溶液。

组分用量
Neurobasal 培养基98 mL
L-谷氨酰胺1 mL
B-27 补充剂2 mL
B-27 Plus 补充剂
10 mL
FBS1 mL
抗坏血酸溶液0.1 mL

制备基质

中脑神经细胞培养基质

  1. 在蒸馏水中以 1:500 的比例制备多聚-L-鸟氨酸稀释液，使得最终浓度为 20 μg/mL。
  2. 向 35 mm 培养皿中加入 2 mL 20 μg/mL 多聚-L-鸟氨酸溶液（4 孔板或玻片：0.5 mL，8 孔玻片：0.25 mL）。
  3. 在 37°C、5% CO2 的湿润环境中孵育培养容器至少 2 小时。
  4. 用蒸馏水冲洗培养容器一次。
  5. 在蒸馏水中以 1:100 的比例制备层黏连蛋白稀释液，使得最终浓度为 10 μg/mL。
  6. 向 35 mm 培养皿中加入 2 mL 10 μg/mL 层黏连蛋白溶液（4 孔板或玻片：0.5 mL，8 孔玻片：0.25 mL）。
  7. 在 37°C、5% CO2 的湿润环境中孵育培养容器至少 2 小时。使用前在 4°C 下储存。


注：您可以提前包被平板并将它们储存于 2-8°C 下，使用 Parafilm 紧密包裹储存长达 4 周。

从中脑腹侧分离和培养前体细胞

除采集子宫角的初始步骤外，均在无菌条件下在层流净化罩中工作或向试剂中添加抗生素（标准浓度的青霉素/链霉素）。及时执行步骤，将组织放置冰上冷却并在整个程序中浸入冰冷缓冲液中。

采集胚胎

  1. 利用无菌技术，采集同期妊娠大鼠（妊娠 E14 分期）或小鼠（妊娠 E13 分期）的子宫角。
  2. 将子宫角浸入含冰冷、无菌 HBSS 的 100 mm 皮氏培养皿中，并用 15 mL 冰冷、无菌 HBSS 小心冲洗 2-3 次。
  3. 将子宫角转移至含解剖缓冲液的干净 100 mm 皮氏培养皿中。
  4. 在层流罩中放置的解剖显微镜下，从子宫囊中切开每个胚胎并去除羊膜。
  5. 使用 Moria 穿孔勺子将胚胎转移至含冰冷解剖缓冲液的干净无菌皮氏培养皿中。
  6. 通过测量和记录胚胎的顶臀长度（E14 大鼠或 E13 小鼠胚胎为 10-12 mm）确认胎龄。排除任何畸形或其他损坏的胚胎。


切开脑

  1. 使用显微切割剪刀或解剖刀对每只胎仔进行断头。
  2. 用镊子固定前脑或后脑区域附近的组织，以避免损伤感兴趣的中脑区域。仔细切开并去除重叠的头皮组织以分离脑。
  3. 将分离的脑置于含解剖缓冲液的干净 60 mm 皮氏培养皿（置于冰上）中。
  4. 使用镊子在前脑或后脑区域附近固定脑，使用解剖刀或微型剪刀小心取出前脑和后脑区域并弃去。使吻侧切口靠近前脑囊泡和丘脑区域，尾部切口靠近峡部区域。


切开中脑腹侧

  1. 使用专用镊子将获得的中脑管固定在中脑后验区域，该区域使用背侧中线处的凸曲率进行标记。
  2. 使用小的微型剪刀或曲面解剖刀刀片的尖端沿背侧中线逐渐切开中脑管。
  3. 小心打开目前典型的蝶形组织瓣。
  4. 使用镊子彻底去除任何残留的重叠脑膜组织。
  5. 通过切除每侧三分之二的组织，修剪中脑管的最外侧（最背侧）区域（作为解剖标志的界沟的大致外侧/后验）。
  6. 将所得组织块（尺寸约 0.3 mm × 1.0 mm）转移至含冷解剖缓冲液的锥形管（置于冰上）中。每块 VM 组织使用约 0.2 至 0.5 mL 缓冲液体积。


解离细胞

  1. 通过使组织块下沉到锥形管的底部，在冷解剖缓冲液（例如，15 mL 锥形管中的 15 mL 缓冲液）中洗涤 VM 组织块。吸出培养基并用新鲜的缓冲液填充管。
  2. 吸出缓冲液，向每 10 块 VM 组织中加入 1 mL StemPro® Accutase®。在 37°C 下孵育组织 3-15 分钟。观察酶切过程，并通过检测解离和均质化确定最佳持续时间。避免过度酶切，
  3. 使用较小直径的火抛光巴斯德吸管，通过上下吹吸组织共约 20 次，轻轻分离组织块。或者，您可以首先使用带 1000 μL 吸头的移液器然后使用带 200 μL 吸头的移液器分离和匀浆组织。避免在 VM 组织的机械解离过程中过度形成气泡，因为这会降低细胞活力。
  4. 如果溶液中仍有大块组织，可选择性地对组织块单独匀浆。
  5. 可选：转移细胞悬浮液，使其通过细胞滤网盖或 35 至 70 μm 筛网。为尽可能减少此过滤步骤中的细胞损失，在过滤细胞悬浮液后，用少量培养基冲洗过滤膜。
  6. 在 4°C 下以 200 × g 离心细胞悬浮液 3-5 分钟。吸出上清液。
  7. 使用分化培养基重悬细胞。每 10 块原始分离的中脑组织中使用 200 μL 分化培养基。
  8. 使用细胞悬浮液等份试液，通过染料排斥法（台盼蓝）测定细胞浓度和活力。使用计数的活细胞数量计算细胞浓度。细胞活力需要 > 80%，理想情况下范围应为 95%-100%。DA 神经元是溶液中最脆弱的细胞之一。虽然经过相对严格的处理后，培养物将包含神经元细胞类型，但 DA 神经元数量较少。
  9. 使用前将细胞悬浮液放置在冰上或 4°C 下。


培养中脑神经细胞

  1. 从多聚-L-鸟氨酸和层黏连蛋白包被的培养板中吸出层黏连蛋白，并将中脑神经细胞铺到分化培养基中，铺板密度为 2 × 105-5 × 105 个细胞/cm2。
  2. 在培养箱中培养细胞，每隔一天更换培养基。
  3. 培养细胞 3-10 天，然后使用抗神经元标记物 β-III-微管蛋白和多巴胺能标记物酪氨酸羟化酶 (TH) 抗体通过免疫细胞化学染色检查 DA 神经元

参考文献

  • Pruszak, J., Just, L., Isacson, O. and Nikkhah, G. 2009.Isolation and Culture of Ventral Mesencephalic Precursor Cells and Dopaminergic Neurons from Rodent Brains.Curr.Protoc.Stem Cell Biol.2D.5.1–2D.5.21.
LT152                    2011 年 3 月 17 日

仅供科研使用，不可用于诊断目的。