大鼠胎仔神经干细胞的培养

大鼠神经干细胞 (NSC) 是用于研究人脑发育、疾病过程和衰弱性中枢神经系统 (CNS) 疾病治疗策略的已确定模型。本方案描述了大鼠胎仔 NSC 在贴壁或神经球悬浮培养物中的体外扩增、传代和形态。

所需材料

细胞

• Gibco 大鼠胎仔神经干细胞（货号 N7744-100）或使用交配后 14-18 天的大鼠脑组织制成的均匀细胞制备液

培养基和试剂

• Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (D-PBS)（货号 14040）
• 不含钙或镁的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (D-PBS)（货号 14190）
• StemPro NSC SFM（货号 A10509-01）
• StemPro Accutase 细胞解离试剂（货号 A11105-01）
• CELLstart CTS（货号 A10142-01）
• 台盼蓝（货号 15250）（随 Countess 自动细胞计数仪提供）或 LIVE/DEAD 细胞活力检测试剂盒（货号 L34951）

专用工具

• Countess 自动细胞计数仪（货号 C10227）或血细胞计数器

用于扩增神经干细胞的培养基

StemPro NSC SFM 完全培养基包括 KnockOut D-MEM/F-12 以及 StemPro 神经补充剂、bFGF、EGF 和 GlutaMAX-I。在 2-8°C 下避光储存时，完全培养基可稳定放置 4 周。

制备 100 mL 完全培养基需要：

1. 使用 0.1% BSA 溶液（溶于 KnockOut D-MEM/F-12）复溶 bFGF 与 EGF，使得浓度为 100 μg/mL。每 100 mL 完全培养基中各需要 20 μL。分装冷冻未使用的部分。
   
2. 在无菌条件下混合下列组分。如需使用更大体积，请按比例增加组分用量。

您可能在解冻 StemPro 神经补充剂的过程中发现白色沉淀；完全解冻或溶解后沉淀将消失

对于贴壁培养，按照如下所述制备含 CELLstart CTS 的平板。

1. 在含钙和镁的 D-PBS 中以 1:100 稀释 CELLstart CTS（例如，将 50 μL CELLstart CTSinto 加入 5 mL D-PBS 中）。
   注：CELLstart CTS 不应冷冻、涡旋或由于可能形成凝胶而进行高强度搅拌。
   
2. 用 CELLstart CTS 的工作溶液包被培养容器的表面（T-75 培养瓶：14 mL，T-25 培养瓶：7 mL，60 mm 培养皿：3.5 mL，35 mm 培养皿：2 mL）。
   
3. 在 37°C、含 5% CO₂ 的湿润环境中孵育培养容器 1 小时。
   
4. 从培养箱中取出容器，使用前在 4°C 下储存。临使用前去除所有 CELLstart CTS 溶液，并用完全 StemPro NSC SFM 填充容器。

注：您可以提前包被平板并将它们储存于 4°C 下，使用 Parafilm® 紧密包裹储存长达 2 周。请在临使用包被平板前去除 CELLstart CTS 溶液。请确保平板不会变干。

贴壁培养

1. 重悬大鼠胎仔 NSC，如下所示：
   
   • 对于新制备的大鼠胎仔 NSC，用 D-PBS 冲洗后将其重悬于温热的完全 StemPro NSC SFM 中，使得密度为 1 × 10⁷ 个活细胞/mL。
   • 对于解冻的大鼠胎仔 NSC，在测定活细胞计数后将其重悬于温热的完全 StemPro® NSC SFM 中，使得细胞密度为 1 × 10⁷ 个活细胞/mL。
2. 将大鼠胎仔 NSC 铺到 CELLstart CTS 包被的培养容器中，铺板密度为 5 × 10⁴ 个细胞/cm²。有关常见培养容器的建议接种密度，请参见下表。
   
   

   容器尺寸	生长面积	培养基体积	细胞数量
   96 孔板	0.32 cm2/孔	0.1 mL	1.6 × 104
   24 孔板	1.9 cm2/孔	0.5 mL	1.0 × 105
   12 孔板	3.8 cm2/孔	1 mL	1.9 × 105
   35 mm 培养皿	8 cm2/孔	2 mL	4.0 × 105
   6 孔板	9.6 cm2/孔	2 mL	4.8 × 105
   60 mm 培养皿	19.5 cm2	5 mL	9.8 × 105
   T-25 培养瓶	25 cm2	5 mL	1.3 × 106
   100 mm 培养皿	55 cm2	10 mL	2.8 × 106
   T-75 培养瓶	75 cm2	15 mL	3.8 × 106

3. 向各培养容器中加入适当体积的细胞，并在 37°C、5% CO ₂ 和 90% 湿度条件下孵育。
4. 每 2-3 天使用新鲜的完全 StemPro NSC SFM 对大鼠胎仔 NSC 培养物进行重新换液。大鼠胎仔 NSC 的形态应表现为密度均匀的短星状突起（参见下图 1）。
   
   
   图 1.使用 StemPro NSC SFM 进行贴壁培养的第 3 代大鼠胎仔 NSC。
   
   
5. 当细胞汇合度达到 75%-90% 时（接种后 3-4 天），大鼠胎仔 NSC 培养物即可传代。
6. 用不含钙和镁的 D-PBS 冲洗培养容器一次，然后去除培养基。
7. 加入预热的 StemPro Accutase，使细胞从培养物表面分离（约 30 秒内）。
8. 分离后，轻轻上下吹吸细胞，将细胞团块分解成均匀的细胞悬浮液，并向培养容器中加入四体积的完全 StemPro NSC SFM。
9. 通过在培养物表面上吹吸数次使细胞分散，以生成均匀的细胞溶液。
10. 将细胞转移至无菌离心管中并在室温下以 300 × g 离心 4 分钟。吸出并弃去培养基。
11. 将细胞沉淀重悬于最小体积的预热完全 StemPro NSC SFM 中，并取出样本进行计数。
12. 利用台盼蓝染色剂或 LIVE/DEAD 细胞活力检测试剂盒测定细胞总数和活力百分比。
13. 向试管中加入足够的完全 StemPro NSC SFM，使得细胞溶液最终浓度为 1 × 10⁶ 个活细胞/mL。在 37°C、5% CO₂ 和 90% 湿度条件下孵育。大鼠胎仔 NSC 培养不应超过 3 代。

重要提示：如果您使用完全 StemPro NSC SFM 以外的生长培养基对大鼠胎仔 NSC 进行重新换液，请确保培养基添加有 10 ng/mL bFGF，以维持大鼠胎仔 NSC 的未分化状态。

1. 重悬大鼠胎仔 NSC，如下所示：
   
   • 对于新制备的大鼠胎仔 NSC，用 D-PBS 冲洗后将其重悬于温热的完全 StemPro NSC SFM 中，使得细胞密度为 1 × 10⁷ 个活细胞/mL。
   • 对于解冻的大鼠胎仔 NSC，在测定活细胞计数后将其重悬于温热的完全 StemPro NSC SFM 中，使得细胞密度为 1 × 10⁷ 个活细胞/mL。
2. 将大鼠胎仔 NSC 铺到未包被或低吸附的培养容器中，铺板密度为 2 × 10⁵ 个活细胞/cm²。有关推荐的接种密度，请参见下表。
   
   

   容器尺寸	生长面积	培养基体积	细胞数量
   96 孔板	0.32 cm2/孔	0.1 mL	6.4 × 104
   24 孔板	1.9 cm2/孔	0.5 mL	3.8 × 105
   12 孔板	3.8 cm2/孔	1 mL	7.6 × 105
   35 mm 培养皿	8 cm2/孔	2 mL	1.6 × 106
   6 孔板	9.6 cm2/孔	2 mL	1.9 × 106
   60 mm 培养皿	19.5 cm2	5 mL	3.9 × 106
   T-25 培养瓶	25 cm2	5 mL	5.0 × 106
   100 mm 培养皿	55 cm2	10 mL	1.1 × 107

3. 向各培养容器中加入适当体积的细胞，并在 37°C、5% CO ₂ 和 90% 湿度条件下孵育。
4. 每 2-3 天使用新鲜的完全 StemPro NSC SFM 对大鼠胎仔 NSC 的神经球悬浮液进行重新换液，而不取出任何发育中的神经球。神经球的形态应表现为球形和透明的多细胞复合物（参见图 2）。
   
   
   图 2.使用 StemPro NSC SFM 进行神经球培养的第 3 代大鼠胎仔 NSC。
   
   
5. 当神经球直径达到 3.5 mm 或更大时，大鼠胎仔 NSC 即可传代。
6. 将神经球悬浮液转移至无菌离心管中，让神经球利用重力沉降或以 200 × g 离心 2 分钟。小心地吸出上清液，将神经球保留在最小体积的培养基中。
7. 用不含钙和镁的 D-PBS 冲洗神经球一次，保留最小体积的 D-PBS。
8. 向神经球中加入 1 mL 预热的 StemPro® Accutase，并在室温下孵育 10 分钟。
9. 孵育后，轻轻上下吹吸细胞，得到单细胞悬浮液，并向试管中加入 4 mL 完全 StemPro NSC SFM。
10. 在室温下以 300 × g 离心 4 分钟，小心吸出上清液，将细胞重悬于最小体积的预热完全 StemPro NSC SFM 中，并取出样本，在血细胞计数器或 Countess 自动细胞计数仪上计数。
11. 测定细胞总数和活力百分比。
12. 向试管中加入足够的完全 StemPro NSC SFM，使得细胞溶液最终浓度为 1 × 10⁷ 个活细胞/mL。在 37°C、5% CO₂ 和 90% 湿度条件下孵育。神经球悬浮培养不应超过 3 代。
    

重要提示：如果您使用完全 StemPro NSC SFM 以外的生长培养基对大鼠胎仔 NSC 进行重新换液，请确保培养基添加有 10 ng/mL bFGF，以维持大鼠胎仔 NSC 的未分化状态。