Characterizing Neural Cells by qPCR

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介绍

定量聚合酶链反应 (qPCR) 是一种研究基因调控的极为准确和灵敏的方法,可用于测定神经干细胞 (NSC) 中特定基因的表达水平。这些基因可用于鉴定 NSC 及其各自的亚谱系。在此,我们提供了使用 Applied Biosystems 7300 实时荧光定量 PCR 系统和 Platinum® SYBR® Green qPCR SuperMix-UDG 及 ROX 参比染料进行 qPCR 的指南和通用方案。

所需材料

起始材料


从神经干细胞 (NSC) 分离的总 RNA 生成的 cDNA(参见“神经干细胞的 RNA 分离和 cDNA 制备”)

培养基和试剂

  • Platinum® SYBR® Green qPCR SuperMix-UDG(货号11733-038、11733-046)
  • SuperScript® VILO™ cDNA 合成试剂盒(货号11754-050、11754-250)
  • TRIzol® 试剂(货号15596-018、15596-026)
  • 定制引物

专用工具

  • Applied Biosystems 7300 实时荧光定量 PCR 系统或类似仪器
  • 0.2 mL 微量离心管或 96 孔或 384 孔 PCR 板
  • 涡旋混合器
  • 微量离心机

方法

模板制备

进行 qPCR 之前,按照“神经干细胞的 RNA 分离和 cDNA 制备”中描述的方案,制备由 10 pg-1 μg 总 RNA 生成的 cDNA 的 1:10 连续稀释液。

实时荧光定量 PCR 仪

Platinum® SYBR® Green qPCR SuperMix-UDG 可与多种实时仪器配合使用,包括但不限于以下 Applied Biosystems 仪器:7300 和 7500 实时荧光定量 PCR 系统;PRISM® 7000、7700 和 7900HT;以及 GeneAmp® 5700。不同仪器的最佳循环条件不同。

引物设计

引物设计是使用 SYBR® Green qPCR 检测系统时最重要的参数之一。我们强烈建议使用引物设计程序,如 OligoPerfect™ 或 Vector NTI Advance® 软件。设计引物时,扩增子长度应约为 80-250 bp。要获得较佳结果,可能需要在
100 nM 和 500 nM 范围内调整引物浓度。对于大多数反应,每条引物的最终浓度为 200 nM 时反应效率较高。

ROX 参比染料

建议使用 ROX 参比染料,从而对兼容该选项的仪器的荧光报告基因信号进行归一化。ROX 在 Platinum® SYBR® Green qPCR SuperMix-UDG 中以单管规格提供,浓度为 25 μM。使用下表确定与特定仪器配合使用时的 ROX 用量。


仪器每 50 μL 反应体系的 ROX 用量ROX 最终浓度
Applied Biosystems 7300、7000、7700、7900HT 和 7900HT Fast1.0 μL500 nM
Applied Biosystems 75000.1 μL50 nM


qPCR 方案

针对特定仪器的方案

在本部分中,我们提供了在 7300 实时荧光定量 PCR 系统 (Applied Biosystems) 上以 20 μL 规格进行 qPCR 的分步方案。

  1. 按如下所示对实时仪器进行编程。最佳温度和孵育时间可能有所不同。

    • 50°C 保持 2 分钟(UDG 孵育)
    • 95°C 保持 2 分钟
    • 40-50 个以下循环:
      • 95°C,15 秒
      • 60°C,30 秒

    熔解曲线分析:对仪器进行编程用于熔解曲线分析,以确定是否存在引物二聚体,并分析反应的特异性。下面列出了典型的熔解曲线程序(有关详细信息,请参阅您的仪器文件):

    • 95°C 保持约 30 秒
    • 45°C 保持约 30 秒
    • 99°C 保持约 30 秒

    升温速率为 2%,收集 45-99°C 的数据

    注:在以下步骤中,请勿触摸每支管的底部,并确保佩戴无粉手套操作所有试剂和塑料器具。
  2. 对于每个反应,向 0.2 mL 微量离心管或 PCR 板的各孔中加入以下组分。列出了单个 20 μL 反应体系所需的体积。对于多重反应,制备共同组分的预混液,向各管或板孔中加入适当的体积,然后加入特有的反应组分(例如模板)。对于无模板对照,可加入等体积的水代替模板。

    组分用量
    Platinum® SYBR® Green qPCR SuperMix-UDG10 μL
    ROX 参比染料(用量根据 AB 7300 系统确定)0.4 μL
    正向引物,10 μL0.4 μL
    反向引物,10 μL0.4 μL
    模板 cDNA(来自 10 pg 至 1 μg 总 RNA 的 1:10 连续稀释液)1-2 μL
    经 DEPC 处理的水加至 20 μL
  3. 盖上或密封反应管/PCR 板,轻轻混匀。确保所有组分都在试管/平板的底部;如有需要可短暂离心。
  4. 将反应体系放置在预热的实时仪器中,仪器按步骤 1 中所述进行编程。使用仪器软件收集数据并分析结果。

图 1. 人胚胎干细胞衍生 NSC 中的巢蛋白转录本的 qPCR 检测。






图 2.
人胚胎干细胞衍生 NSC 中的 Sox1 转录本的 qPCR 检测。




LT145                   2011 年 3 月 17 日