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星形胶质细胞目前是中枢神经系统 (CNS) 中最丰富的细胞类型，并在成人 CNS 稳态方面起到关键作用。它们为神经元和形成血脑屏障的内皮细胞提供生化和营养支持、执行绝大多数突触谷氨酸摄取以及维持细胞外钾水平（Rothstein 等人，1996；Rothstein 等人，1994）。尽管皮层和海马星形胶质细胞之间的已知差异很少，但据报告，来自脑不同区域的星形胶质细胞对缺血性损伤表现出不同的敏感性（Xu 等人，2001；Zhao 和 Flavin，2000）。
以下方案提供了使用 Lipofectamine LTX 试剂或 Lipofectamine RNAiMAX 试剂将质粒 DNA 或 siRNA 脂质介导转染至 Gibco 人星形胶质细胞的说明。Lipofectamine LTX 试剂是一种用于将 DNA 转染至真核细胞的专利非动物源性配方，细胞毒性较低。Lipofectamine RNAiMAX 是一种专为将 siRNA 和 Stealth RNAi 双链体转染至真核细胞而开发的专利配方。
所需材料
- Gibco 人星形胶质细胞（货号 N7805-100）
- Gibco 星形胶质细胞培养基（货号 A12613-01）
注：培养基套装包含 N-2 补充剂 (100X)（货号 17502-048）、Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (D-MEM) (1X)（液体）（货号 10569-010）和经认证的 One Shot 胎牛血清 (FBS)（货号 16000-077）。 - Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (D-PBS) (1X)（液体），不含 Ca2+ 和 Mg2+ 或酚红（货号 14190-144）
- Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (D-PBS) (1X)（液体），含 Ca2+ 和 Mg2+（货号 14040-133）
- Geltrex 低生长因子基底膜基质（货号 12760）
- StemPro Accutase 细胞解离试剂（货号 A11105）
- Opti-MEM I 减血清培养基（货号 31985-062）
- 适当的组织培养板和用品
用于转染质粒 DNA
- 感兴趣的质粒 DNA（100 ng/μL 或更高）
- Lipofectamine LTX 试剂和 PLUS 试剂（货号 15338-100）
用于转染 siRNA
在进行脂质介导的人星形胶质细胞转染时，请遵循以下重要指南：
- 使用 Geltrex 基质包被平板培养人星形胶质细胞。
- 在转染过程中向培养基中添加抗生素可能导致细胞死亡。如果您希望在转染过程中使用抗生素，请对您的条件进行全面测试。
- 在实验之间维持相同的接种条件。使用低代数细胞；确保转染前细胞健康且存活率超过 90%。
- 可以在存在或不存在血清的情况下进行转染。测试无血清培养基与 Lipofectamine LTX 或 Lipofectamine RNAiMAX 试剂的兼容性。
- 使用 PLUS™ 试剂可增强在人星形胶质细胞中的转染性能。
- 我们建议在混合前使用 Opti-MEM I 减血清培养基稀释 DNA 和 Lipofectamine LTX 试剂或 siRNA 和 Lipofectamine RNAiMAX 试剂。
在对 Gibco 人星形胶质细胞进行解冻或传代之前，按如下所述制备 Geltrex® 基质包被的培养容器。
- 在 4°C 下过夜解冻一瓶 Geltrex 基底膜基质。
- 在冰上用 D-MEM 按 1:1 稀释 Geltrex 基质，制备储备液。分装储存于 -20°C，直至需要使用。
- 用 D-MEM 按 1:100 稀释储备液，并包被各培养容器的底部（每 cm2 培养容器使用 200 μL Geltrex® 基质）。
- 在 37°C 下孵育培养容器 1 小时。包被有 Geltrex 基质的培养皿可立即使用，或用 Parafilm 密封后在 4°C 下储存长达一周。不要让培养皿变干。准备添加细胞前，吸出 Geltrex 基质溶液，使用含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 D-PBS 冲洗平板一次，然后添加细胞溶液。
在无菌条件下混合以下组分，制备 100 mL Gibco® 星形胶质细胞完全培养基。在 4°C 下避光储存时，星形胶质细胞完全培养基可稳定储存 2 周。
| 组分 | 每 100 mL 的用量 | 每 500 mL 的用量 |
|---|---|---|
| D-MEM | 89 mL | 445 mL |
| N-2 补充剂 | 1 mL | 5 mL |
| FBS | 10 mL | 50 mL |
注：添加最终浓度为 20 ng/mL 的 EGF 可促进增殖，但也可能导致人星形胶质细胞的形态和表型发生变化。
- 在使用前将星形胶质细胞完全培养基和 StemPro Accutase 细胞解离试剂置于 37°C 水浴中加热。
- 将条件培养基从细胞转移至新试管中；将用于终止步骤 6 的酶反应。
- 使用不含钙、镁或酚红的 1X D-PBS 洗涤细胞一次。
- 吸出 D-PBS 并将 StemPro Accutase 加入细胞。
- 37°C 孵育 5-10 分钟。约每 5 分钟晃动一次细胞，并在显微镜下检查是否分离和解离成单细胞。
- 细胞分离后，加入等体积 (1:1) 的条件培养基（来自步骤 2），以降低 Accutase 活性。
- 将细胞转移至 15 mL 或 50 mL 试管中。
- 用完全培养基冲洗培养容器，并将其加入试管中。
- 以 200 × g 离心试管 4 分钟。
- 吸出并弃去上清液。
- 将沉淀温和重悬于星形胶质细胞完全培养基中。
- 使用所选方法进行活细胞计数。
- 如需对人星形胶质细胞进行重新铺板，可从 4°C 储存中取出 Geltrex 基质包被平板，略微倾斜以吸出 Geltrex 基质溶液。使用含钙和镁的 D-PBS 冲洗一次平板。不要让平板变干。
- 立即接种所需浓度（建议 ≥ 2 × 104 个细胞/cm2）的星形胶质细胞。
- 在含 5% CO2、37°C 的湿润 (90%) 培养箱中孵育细胞。使用新鲜的星形胶质细胞完全培养基每 2-3 天更换一次培养基。
按照该程序，可使用 Lipofectamine LTX 试剂以 24 孔规格将质粒 DNA 转染到 Gibco 人星形胶质细胞中（对于其他规格，请参见下面的扩大或缩小转染规模）。所有用量和体积均按每孔给出。
- 转染前一天，准备好从冻存状态复苏的人星形胶质细胞并使汇合度达到 80%。使用 StemPro Accutase 分离细胞并对细胞进行计数。在 0.5 mL 完全生长培养基中铺板 5 × 104 个细胞/孔。转染当天细胞密度应达到 80%-90% 汇合度。
- 对于每孔待转染的细胞，将 0.5 μg DNA 稀释到不含血清的 100 μL Opti-MEM I 减血清培养基中。
- 使用 PLUS 试剂：使用前轻轻混合 PLUS 试剂，然后将 0.5 μL PLUS 试剂（与 DNA 的比例为 1:1）直接加入稀释的 DNA 中。轻轻混匀，室温孵育 5-15 分钟。
- 对于每孔细胞，将 1.5-3.0 μL Lipofectamine LTX 稀释到上述稀释的 DNA 溶液中，轻轻混匀并且室温孵育 25 分钟，以形成 DNA-Lipofectamine LTX 复合物。
- 从细胞中移除生长培养基，并替换为 0.5 mL 完全生长培养基。将 100 μL 的 DNA-Lipofectamine LTX 复合物直接添加到每个含有细胞的孔中，并通过来回摇动平板轻轻混匀。
- 转染后不必除去复合物。转染后，在 CO2 培养箱中于 37°C 下孵育细胞 18-24 小时，然后测定转基因表达。
扩大或缩小转染规模
如需在不同尺寸的组织培养容器中转染人星形胶质细胞，请按表中所示与相对表面积成比例地调整所用 Lipofectamine LTX 试剂、DNA、细胞、培养基和 PLUS 试剂的用量（用量按每孔给出）。
| 培养容器 | 每孔表面积* | 铺板培养基体积 | 每孔细胞数 | 稀释培养基体积† | DNA | Lipofectamine LTX 试剂 | PLUS 试剂 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 96 孔 | 0.3 cm2 | 100 μL | 1.0 × 104 | 20 μL | 100 ng | 0.3-0.6 μL | 0.1 μL |
| 48 孔 | 1 cm2 | 200 μL | 2.0 × 104 | 40 μL | 200 ng | 0.6-1.2 μL | 0.2 μL |
| 24 孔 | 2 cm2 | 500 μL | 5.0 × 104 | 100 μL | 500 ng | 1.5-3.0 μL | 0.5 μL |
| 12 孔 | 4 cm2 | 1 mL | 1.0 × 105 | 200 μL | 1 μg | 3.0-6.0 μL | 1.0 μL |
| 6 孔 | 10 cm2 | 2 mL | 2.5 × 105 | 500 μL | 2.5 μg | 7.5-15.0 μL | 2.5 μL |
| * 不同生产商的表面积可能不同。† 如果 Lipofectamine LTX 试剂的体积太少而无法准确分配，且不能合并稀释液，则使用 Opti-MEM I 减血清培养基将 Lipofectamine LTX 试剂预稀释 10 倍，再分配 10 倍相应量（每孔应至少 1.0 μL）。丢弃所有未使用的已稀释 Lipofectamine LTX 试剂。 | |||||||
制备 siRNA
- 用不含核酸酶的水重悬 Silencer Select siRNA。便利的储备液浓度为 100 μM，可根据下游实验需要进行稀释。
- 使用分光光度计测定 260 nM 处的吸光度来验证 siRNA 的浓度，并根据需要用水调节。分装冷冻储存于 -20°C。
- 将 100 μM 的 siRNA 储备液稀释至 10 μM 工作浓度。
- 在 20 μL/孔的 Opti-MEM I 中稀释 siRNA 工作储备液，使试管或平板中的最终浓度达到 30 nM 或所需浓度 (1 nM-100 nM)。如适用，将预混液制成重复样品，以尽量减少变异性（至少一个孔过量）。例如，使用 10 μM siRNA 储备液时，混合 0.39 μL siRNA (3.9 pmol) + 19.61 μL/孔 Opti-MEM-I 或 1.56 μL siRNA + 78.44 μL Opti-MEM-I，制备预混液。
- 采用生产商提供的合适包被方法，将 siRNA 铺到 Geltrex 基质包被平板上
制备细胞
按照生产商的细胞方案培养细胞。细胞培养时间约一周。转染当天，按照方案收获细胞。对细胞进行计数并稀释至适当密度。我们建议进行初始优化实验，以确定最佳细胞密度。根据我们的优化结果，我们发现 4,000 个细胞/孔是最佳细胞密度。
转染细胞
我们建议进行初始优化实验，以确定转染试剂的最佳用量，从而平衡敲低效果和低毒性。根据我们的优化结果，我们发现 0.15 μL/孔的 Lipofectamine RNAiMAX 是最佳条件。
- 在 12 × 75 mm 聚苯乙烯试管或锥形离心管中，用 Opti-MEM I 稀释 0.15 μL/孔的 Lipofectamine RNAiMAX，使总体积为 10 μL/孔。制备足够体积的预混液，用于处理所有待转染的孔并且考虑额外 10% 的移液变异性。轻弹试管底部，混合 Lipofectamine RNAiMAX-Opti-MEM I 混合物。
- 对于每 20 μL 稀释和预铺板的 siRNA，加入 10 μL Lipofectamine RNAiMAX-Opti-MEM I 混合物。通过来回轻敲平板进行混合。室温孵育该混合物 10 分钟。
- 孵育后，向每孔中加入 80 μL 稀释至适当密度的人星形胶质细胞。每孔的最终体积应为 110 μL/孔。
- 将平板置于 37°C 培养箱中于正常细胞培养条件下进行培养。在目标时间点（通常为转染后 24-48 小时）取出细胞并测定感兴趣基因的表达水平。
- Rothstein JD, Dykes-Hoberg M, Pardo CA, Bristol, et al.(1996) Knockout of glutamate transporters reveals a major role for astroglial transport in excitotoxicity and clearance of glutamate.Neuron 16:675–686.
- Rothstein JD, Martin L, Levey AI, et al.(1994) Localization of neuronal and glial glutamate transporters.Neuron 13:713–725.
- Xu L, Sapolsky RM, Giffard RG (2001) Differential sensitivity of murine astrocytes and neurons from different brain regions to injury.Exp Neuro 169:416–424.
- Zhao G, and Flavin MP (2000) Differential sensitivity of rat hippocampal and cortical astrocytes to oxygen-glucose deprivation injury.Neurosci Lett 285:177–180.
LT158 2011 年 3 月 17 日