使用 Neon 转染系统转染神经细胞

Neon 转染系统是一种台式电穿孔设备，利用移液器吸头作为电穿孔室高效转染原代细胞和干细胞等哺乳动物细胞。有关使用 Neon 转染系统转染神经细胞的说明如下所述。有关使用 Neon 转染系统的详细说明，请参阅产品随附的手册或下载产品手册。有关各种神经细胞系的培养条件的详细信息，请参阅您所使用的特定细胞系随附的说明。

所需材料

• 感兴趣神经细胞系
• 用于您的神经细胞系的生长培养基和生长因子
• 感兴趣质粒 DNA（1-5 μg/mL，溶于去离子水或 TE 中）
• Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (D-PBS) (1X)（液体，），不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺（货号 14190-144）
• Neon 转染系统（货号 MPK5000）
• Neon 试剂盒，10 μL（货号 MPK1096）或 Neon 试剂盒，100 μL（货号 MPK10096）
• 适当的组织培养板和用品

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下表总结了各种神经细胞系（包括神经干细胞）的培养条件。有关这些细胞培养和传代的详细说明，请参阅您所使用的特定细胞系随附的说明。

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完全 StemPro NSC SFM

要制备 100 mL 完全 StemPro NSC SFM，请以无菌方式混合下表所列组分。在 4°C 下避光储存时，完全培养基可稳定放置 4 周。

完全 GIBCO 星形胶质细胞培养基

要制备 100 mL 完全 GIBCO NSC SFM，请以无菌方式混合下表所列组分。在 4°C 下避光储存时，完全培养基可稳定放置 2 周。

注：添加最终浓度为 20 ng/mL 的 EGF 可促进增殖，但也可能导致人星形胶质细胞的形态和表型发生变化。

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使用 10 μL Neon 试剂盒，使用此程序在 24 孔板中将质粒 DNA 转染至 hNSC。所有用量和体积均按每孔给出。

1. 于适当的生长培养基中培养所需的细胞数（参见下表），使得实验当天细胞达到 70%-90% 的汇合度。
2. 在实验当天，在不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 收获中收获并洗涤细胞。
3. 将细胞沉淀重悬于重悬缓冲液 R（包含在 Neon 试剂盒中）中，以达到适当的最终密度（参见下表）。
4. 通过使用不含抗生素的 0.5 mL 适当的生长培养基填充孔制备 24 孔板，在 37°C、含 5% CO₂ 的培养箱中预孵育平板。如使用其他类型的平板规格，则需相应调整体积。
5. 打开 Neon 装置，然后在输入窗口中输入以下电穿孔参数。或者，按下数据库按钮并选择合适的转染方案（如果您已经为您的细胞类型添加了电穿孔参数）。有关详细说明，请参阅随 Neon 装置提供的手册。
   
   

   细胞类型	细胞密度	脉冲电压 (V)	脉冲宽度 (ms)	脉冲数	Neon 吸头
   人神经干细胞	1 × 107 个细胞/mL	1400 1600 1700	20 20 20	2 1 1	10 μL
   人星形胶质细胞	1 × 107 个细胞/mL	1100 1200	30 40	1 1	10 μL
   大鼠胎仔神经干细胞	1 × 107 个细胞/mL	1300 1500 1600	20 10 10	2 3 3	10 μL
   大鼠原代皮层星形胶质细胞	0.5 × 107 个细胞/mL	1400 1400 1700	20 30 20	2 1 1	10 μL
   大鼠神经胶质前体细胞	1 × 107 个细胞/mL	1300 1500	10 20	3 1	10 μL

   
   
6. 使用 3 mL 缓冲液 E 填充 Neon 管。（如果您使用的是 100 μL Neon 吸头，则使用缓冲液 E2。）
7. 将 Neon 管插入 Neon 移液器工作站，直至听到咔嗒声，表明管已锁定到位。
8. 将 0.5 μg 质粒 DNA 转移到 1.5 mL 无菌微量离心管中。注：用于电穿孔的 DNA 质量和浓度对转染效率起着重要作用。我们强烈建议使用 PureLink™ HiPure 质粒 DNA 纯化试剂盒等高质量质粒纯化试剂盒制备 DNA。
9. 将 1 mL 细胞（在第 3 步中重悬）加入含有质粒 DNA 的管中，并轻轻混合。
10. 将 10 μL Neon 吸头插入 Neon 移液器中。
11. 按下 Neon 移液器上的按钮到第一个停止点，并将 Neon 吸头浸入细胞 DNA 混合物中。缓慢地释放移液器上的按钮，将细胞 DNA 混合物吸出到 Neon 吸头中。
12. 将含样本的 Neon 移液器垂直插入放置在 Neon 移液器工作站中的 Neon 管中，直至听到咔嗒声，表明移液器已锁定到位。
13. 确保您输入了相应的电穿孔参数，并按下 Neon 触摸屏上的“开始”键。Neon 设备根据第 5 步中输入的参数传送电脉冲，触摸显示屏显示完成以指示电穿孔完成。
14. 从 Neon 移液器工作站中取出 Neon 移液器并立即将样本从 Neon 吸头转移至制备的含有适当预热的完全生长培养基（不含抗生素）的培养板中。将 Neon 吸头放入适当的生物危险废弃物容器中。
15. 对剩余的样本重复步骤 10-14。
16. 轻轻摇晃平板，以确保细胞均匀分布。在 37°C、含 5% CO₂ 的湿润培养箱中孵育平板。
17. 检测样本以确定转染效率（例如，荧光显微镜检查或功能检测）。

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人神经干细胞

使用 Neon 转染系统并使用 0.5 μg 质粒（编码祖母绿荧光蛋白 (EGFP)）转染在 StemPro NSC SFM 完全培养基中培养的 GIBCO 人神经干细胞（货号 N7800-100），参数见下表。转染后 48 小时，通过光学显微镜检查（图 A）和荧光显微镜检查（图 B）对细胞进行分析。

A	B

人星形胶质细胞

使用 Neon 转染装置和 0.5 μg 质粒（编码祖母绿荧光蛋白 (EGFP)）转染 GIBCO 人星形胶质细胞（货号 N7805-100）；电穿孔后 24 小时，通过光学显微镜检查（图 A）和荧光显微镜检查（图 B）对细胞进行分析。

A	B

大鼠胎仔神经干细胞

使用 Neon 转染装置和 0.5 μg 质粒（编码祖母绿荧光蛋白 (EGFP)）转染 GIBCO 大鼠胎仔神经干细胞（货号 N7744-100）；电穿孔后 24 小时，通过光学显微镜检查（图 A）和荧光显微镜检查（图 B）对细胞进行分析。

A	B

大鼠原代皮层星形胶质细胞

使用 Neon 转染装置和 0.5 μg 质粒（编码祖母绿荧光蛋白 (EGFP)）转染 GIBCO 大鼠原代皮层星形胶质细胞（货号 N7745-100）；电穿孔后 24 小时，通过光学显微镜检查（图 A）和荧光显微镜检查（图 B）对细胞进行分析。

A	B

大鼠神经胶质前体细胞

使用 Neon 转染装置和 0.5 μg 质粒（编码祖母绿荧光蛋白 (EGFP)）转染 GIBCO 大鼠神经胶质前体细胞（货号 N7746-100）；电穿孔后 24 小时，通过光学显微镜检查（图 A）和荧光显微镜检查（图 B）对细胞进行分析。

A	B

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有关您的细胞培养和传代的疑难解答提示，请参阅细胞随附的手册。有关 Neon 转染系统的疑难解答提示，请参见下文。

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