成熟分化神经细胞的冻存和复苏

原代神经元培养是神经生物学和药理学领域不可或缺的技术。许多研究人员倾向于使用新鲜分离的神经元细胞，因为它们能够维持其功能活力，但为了方便，另一种途径是冻存新鲜细胞供以后使用。本章描述了从新鲜分离的神经细胞生成冻存储备液的过程以及复苏储备液的解冻程序。

大鼠脑细胞

• E18 大鼠脑组织的均一细胞制备描述见“皮层和海马神经元的分离、培养和鉴定”。

培养基和试剂

• Gibco B-27 Plus 神经元培养系统 (A3653401)
  • 包含 Neurobasal Plus 培养基 (A3582901) 和 B-27 Plus 补充剂 (A3582801)
• 台盼蓝（货号 15250-061）
• Synth-a-Freeze 冻存培养基（货号 A12542-01）

设备

• 冻存管
• 异丙醇冻存盒
• -80°C 冷冻冰箱
• 液氮冷冻冰箱
• 37°C 水浴

冷冻神经细胞

1. 按“皮层和海马神经元的分离、培养和鉴定”中所述，在添加 2% B-27 Plus 的 Neurobasal Plus 培养基中分离和制备大鼠脑细胞悬浮液。
2. 使用血细胞计数器进行细胞计数。
3. 以 200 × g 离心细胞 4 分钟。吸出上清液。
4. 在冷的 Synth-a-Freeze 中重悬细胞沉淀，使得浓度为 2.0 × 10⁶-1.0 × 10⁷ 个细胞/mL。
5. 按 1 mL 的体积将细胞混悬液分装到预标记的预冷冻存管中，并将冻存管置于 4°C 异丙醇冻存盒中 10 分钟。
6. 将异丙醇冻存盒转移至 -80°C 过夜。
7. 将冷冻的冻存管转移至液氮蒸气相储存，直至使用。

复苏冷冻的神经细胞

细胞在从冻存状态中复苏时非常脆弱，因此需轻柔处理。在使用移液器吸头和冻存管转移细胞悬浮液之前，务必使用完全 Gibco B-27 Plus 神经元培养系统（Neurobasal/B-27 Plus 补充剂）进行冲洗，以避免细胞粘附在塑料上。在从冻存状态中复苏时不要对细胞进行离心。

1. 从液氮中取出一管冷冻细胞。
2. 在 37°C 水浴中解冻冻存管并轻轻旋转。
3. 用乙醇擦拭冻存管，轻轻敲打表面，使所有培养基聚集在管底部。
4. 在层流净化罩中打开冻存管。
5. 用培养基冲洗移液器吸头，并将管中的细胞非常轻柔地转移至预冲洗的 15 mL 试管中。
6. 用 1 mL 预热的 Neurobasal Plus/B-27 Plus 完全培养基冲洗冻存管，并以每秒一滴的速率将冲洗液转移至含有细胞的 15 mL 试管中。每滴后轻轻旋转混匀。
7. 向试管中缓慢加入 2 mL Neurobasal Plus/B-27 Plus 完全培养基（总悬浮液体积为 4 mL）。
8. 使用 P-1000 移液器非常轻柔地混匀悬浮液。避免产生任何气泡。
9. 使用预冲洗吸头向含有 10 μL 0.4% 台盼蓝的微量离心管中加入 10 μL 细胞悬浮液。轻轻敲击试管以混匀细胞。使用血细胞计数器测定活细胞密度。
10. 在多聚-D-赖氨酸包被的 48 孔板或 8 室玻片中铺板约 1 × 10⁵ 个细胞/孔。通过添加 Neurobasal Plus/B-27 Plus 完全培养基，使细胞悬浮液体积达到 500 μL/孔。
11. 在含 5% CO₂、37°C 的湿润环境中孵育细胞。
12. 每三天换液一次，换液时从各孔吸出一半培养基，然后加入等量新鲜培养基。