介绍

产品说明

本产品适用于阳性磁性分离人外周血单核细胞 (PBMC) 中的 CD4+ T 细胞。第一步，加入 FlowComp 人 CD4 抗体（抗人 CD4 的小鼠 IgG1 抗体），它将结合靶细胞。第二步，使用 Dynabeads 捕获已结合特异性抗体的 CD4+ T 细胞。第三步也是最后一步，Dynabeads 释放细胞。

下游应用

分离的细胞不含微珠，可以直接用于任何下游应用（包括流式细胞分析）。在 Dynabeads® 人 T 活化剂 CD3/CD28（货号 111.31D/111.32D/61D）的作用下，细胞可以轻松增殖，这可通过掺入 EdU（例如 Click-IT™-EdU，货号 A10202）或用 CFSE 检测试剂盒（Invitrogen 货号 C34554）进行测定。有关推荐产品和方案，请访问：免疫学研究指南。


所需的其他材料

  • 分离缓冲液：添加了 0.1% BSA 和 2mM EDTA 且不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（例如 Invitrogen Gibco 货号14190）。BSA 可用人血清白蛋白 (HSA) 或 2% FBS/FCS 代替。
  • 兼具倾斜和旋转功能的混合器。
  • Dynal 磁铁：有关磁铁建议，请参阅 Dynabeads® mRNA 纯化试剂盒（从总 RNA 制备液中纯化 mRNA）。
  • 可选：流式细胞分析抗体试剂。Invitrogen 建议使用抗-CD3-Alexa Fluor 488（Invitrogen 货号 MHCD0320）和抗-CD4-PE（Invitrogen 货号 MHCD0404）作为荧光一抗，以便在分离后进行流式细胞染色。有关推荐产品和方案，请参见免疫学研究指南。 
  • 可选：对于活力分析，建议使用 SYTOX® Red（Invitrogen 货号 S34859）。

重要提示

  • 使用可以倾斜和旋转试管的混合器，确保 Dynabeads 不会沉淀在试管中。
  • 使用前，在小瓶中小心地重悬 Dynabeads，即旋晃 >30 秒或倾斜并旋转5分钟。
  • 本产品不可与 Dynal® MPC™ -1（Invitrogen mDynal 货号 120.01D）配合使用。
  • 移液时，避免出现气泡。
  • 移液体积和孵育时间不得低于建议值。
  • 让所有缓冲液保持低温。
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方案

  • 每 mL 人血约含有 1 x 106 个 T 细胞，其中约有 70% 的 T 细胞会强烈表达 CD4 抗原。
  • 本方案描述了在无表达 CD4 的单核细胞污染的情况下，使用 Dynabeads® FlowComp™ 人 CD4 从 5 x 107 个 PMBC 中磁性捕获和分离 CD4+ T 细胞的步骤。 处理更多细胞时，请相应增加所有试剂体积和总体积。



制备

  • 按标准程序分离抗凝外周血或富含白细胞的血沉棕黄层中的 PBMC。（有关更多信息，请参阅“技术建议”部分）。

  • 用分离缓冲液制备浓度为 1 x 108 个细胞/mL 的单细胞悬液。
  • 每 5 x 107 个细胞制备约 10 mL 分离缓冲液。


分离程序

室温 (RT) 下的所有孵育也可以在 2-8°C 下进行

  1. 从上述悬液中取 500 μL（5 x 107 个细胞），重悬并加入 25 μL FlowComp 人 CD4 抗体。 

  2. 混合均匀并在 2-8°C 下孵育10分钟。

  3. 加入 2 mL分离缓冲液以洗涤细胞，然后以 350 x g 的速度离心8分钟。

  4. 去除并丢弃上清液。

  5. 向细胞团块中加入 1 mL 分离缓冲液并重悬。

  6. 加入 75 μL 重悬后的 FlowComp Dynabeads 并混合均匀。

  7. 在室温下，以滚动、倾斜的方式孵育15分钟

  8. 将试管放在磁铁上至少1分钟。小心地去除并丢弃上清液。

  9. 从磁铁中取出试管。加入至少 1 mL分离缓冲液，并通过轻轻吹打5次来重悬微珠结合细胞。

  10. 将试管放在磁铁上至少1分钟。小心地去除并丢弃上清液。

  11. 从磁铁中取出试管并在 1 mL Flowcomp 释放缓冲液中小心地重悬微珠结合细胞。

  12. 在室温下，以滚动、倾斜的方式孵育15分钟

  13. 吹打10次以混匀细胞，然后将试管放入磁铁1分钟。

  14. 将含有无微珠细胞的上清液转移到新试管中，再将该试管放在磁铁上1分钟以去除残留的微珠。

  15. 将含有无微珠细胞的上清液转移到新试管中。

  16. 加入 2 mL 分离缓冲液，然后以 350 x g 的速度离心8分钟。

  17. 丢弃上清液并在首选培养基中重悬细胞团块。

  18. 在 2-8°C 下保存细胞，直至进一步用于下游应用。

 

技术建议

一般疑难解答

  • 为避免在流式染色过程中非特异性标记细胞，我们建议在荧光一抗染色前先使用丙种球蛋白。
  • 要获得更高的纯度，请重复洗涤步骤一次或将微珠结合细胞转移到新试管中，然后再加入 FlowComp™ 释放缓冲液


从血沉棕黄层制备 PBMC

这种方法得到的血小板数量较低，因此建议与 Dynabeads FlowComp™ 产品配合使用。

  • 在 18-25°C 下，使用含 0.1% BSA + 0.6% 柠檬酸钠或 2 mM EDTA 的 PBS 将 10-18 mL 血沉棕黄层稀释至总体积为 35 mL。
  • 在 15 mL Lymphoprep™ 上添加稀释后的血沉棕黄层。
  • 在 20°C 下，以 160 × g 的速度离心20分钟。在不使用制动器的情况下让其减速。
  • 移除 20 mL 上清液以去除血小板。
  • 在 20°C 下，以 350 × g 的速度离心20分钟。在不使用制动器的情况下让其减速。
  • 从血浆/Lymphoprep™ 分界面回收 PBMC 并将细胞转移至 50 mL 试管中。
  • 在 2-8°C 下，使用含 0.1% BSA 的 PBS 通过以 400 × g 的速度离心8分钟的方式洗涤 PBMC 一次。
  • 在 2-8°C 下，使用含 0.1% BSA 的 PBS 通过以 225 x g 的速度离心8分钟的方式再洗涤 PBMC 一次，然后以 1 x 108 个 PBMC/mL 的浓度在含 0.1% BSA 的 PBS 中重悬细胞。


如果起始样本并非血沉棕黄层，请访问 www.invitrogen.com/cellisolation，了解推荐的 PMBC 制备程序。本网站提供最新版包装说明书/使用说明书。

113.61D_71D   版本003     2009年5月5日

仅供科研使用，不可用于诊断目的。