阳性磁性分离人外周血单核细胞 (PBMC) 中的 CD3+ T 细胞

本方案适用于阳性磁性分离人外周血单核细胞 (PBMC) 中的 CD3⁺ T 细胞。第一步，加入 FlowComp™ 人 CD3 抗体，它将与靶细胞结合。第二步，使用 Dynabeads 捕获已结合特异性抗体的 CD3⁺ T 细胞。第三步也是最后一步，Dynabeads 释放细胞。

下游应用

分离的细胞不含微珠，可以直接用于任何下游应用（包括流式细胞分析）。在 Dynabeads CD3/CD28 T 细胞扩增剂（Invitrogen Dynal 货号 111.31D/111.32D）的作用下，细胞可以轻松增殖，这可通过掺入 EdU（例如 EdU Click-iT，Invitrogen 货号 A10202）或用 CFSE 检测试剂盒（Invitrogen 货号34554）进行测定。 请参阅推荐产品和方案。

所需的其他材料

不包含但执行整个方案需要的材料：

• 分离缓冲液：添加了 0.1% BSA 和 2mM EDTA 且不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（例如 Invitrogen Gibco 货号14190）。BSA 可用人血清白蛋白 (HSA) 或 2% FBS/FCS 代替。
• 兼具倾斜和旋转功能的混合器。
• Dynal 磁铁：请参阅磁铁建议。
• 可选：流式细胞分析抗体试剂。Invitrogen 建议将 CALTAG 的抗 CD3 克隆体 UCHT-1 作为荧光一抗，用于分离后的细胞流式染色（可与不同荧光染料偶联，例如 Invitrogen 货号 CD0304）。可选克隆体：OKT3、HITa3。请参阅推荐产品和方案
• 可选：对于活力分析，建议使用 SYTOX Red（Invitrogen 货号 S34859）。
  

重要提示

• 使用可以倾斜和旋转试管的混合器，确保 Dynabeads 不会沉淀在试管中。
• 使用前，在小瓶中小心地重悬 Dynabeads，即旋晃 >30 秒或倾斜并旋转5分钟。本产品不可与 Dynal MPC™-1（Invitrogen Dynal 货号 120.01D）配合使用
• 移液时，避免出现气泡。
• 切勿使用少于推荐体积的 Dynabeads。
• 请小心遵循推荐的移液体积和孵育时间。
• 让所有缓冲液保持低温

• 按标准程序分离抗凝外周血或富含白细胞的血沉棕黄层中的 PBMC（有关更多信息，请参阅技术建议）。
• 用分离缓冲液制备浓度为 1 × 10⁸ 个细胞/mL 的单细胞悬液。
• 每 5 × 10⁷ 个细胞制备约 10 mL 分离缓冲液。

1. 从上述悬液中取 500 μL（5 x 10⁷ 个细胞），重悬并加入 25 μL FlowComp™ 人 CD3 抗体。


2. 混合均匀并在 2-8°C 下孵育10分钟。


3. 加入 2 mL 分离缓冲液来洗涤细胞，然后以 350 × g 的速度离心8分钟。


4. 去除并丢弃上清液。


5. 向细胞团块中加入 1 mL 分离缓冲液并重悬。


6. 加入 75 μL 重悬后的 FlowComp™ Dynabeads 并混合均匀。


7. 在室温下，以滚动、倾斜的方式孵育15分钟。


8. 将试管放在磁铁上至少1分钟。小心地去除并丢弃上清液。


9. 从磁铁中取出试管。加入至少 1 mL 分离缓冲液，并通过轻轻吹打5次来重悬微珠结合细胞。


10. 将试管放在磁铁上至少1分钟。小心地去除并丢弃上清液。


11. 从磁铁中取出试管并在 1 mL FlowComp™ 释放缓冲液中小心地重悬微珠结合细胞。


12. 在室温下，以滚动、倾斜的方式孵育10分钟。


13. 吹打10次以混匀细胞，然后将试管放入磁铁1分钟。


14. 将含有无微珠细胞的上清液转移到新试管中，再将该试管放在磁铁上1分钟以去除任何残留的微珠。


15. 将含有无微珠细胞的上清液转移到新试管中。


16. 加入 2 mL 分离缓冲液，然后以 350 x g 的速度离心8分钟。


17. 丢弃上清液并在首选培养基中重悬细胞团块。

一般疑难解答

为避免在流式染色过程中非特异性标记细胞，我们建议在荧光一抗染色前先使用丙种球蛋白。

要获得更高的纯度，请重复洗涤步骤一次或将微珠结合细胞转移到新试管中，然后再加入
FlowComp™ 释放缓冲液

从血沉棕黄层制备 PBMC

这种方法得到的血小板数量较低，因此建议与 Dynabeads FlowComp™ 产品配合使用。

• 在 18-25°C 下，使用含 0.1% BSA + 0.6% 柠檬酸钠或 2 mM EDTA 的 PBS 将 10-18 mL 血沉棕黄层稀释至总体积为 35 mL。
• 在 15 mL Lymphoprep™ 上添加稀释后的血沉棕黄层。
• 在 20°C 下，以 160 × g 的速度离心20分钟。在不使用制动器的情况下让其减速。
• 移除 20 mL 上清液以去除血小板。
• 在 20°C 下，以 350 × g 的速度离心20分钟。在不使用制动器的情况下让其减速。
• 从血浆/Lymphoprep™ 分界面回收 PBMC 并将细胞转移至 50 mL 试管中。
• 在 2-8°C 下，使用含 0.1% BSA 的 PBS 通过以 400 × g 的速度离心8分钟的方式洗涤 PBMC 一次。
• 在 2-8°C 下，使用含 0.1% BSA 的 PBS 通过以 225 x g 的速度离心8分钟的方式再洗涤 PBMC 一次，然后以 1 x 10⁸ 个 PBMC/mL 的浓度在含 0.1% BSA 的 PBS 中重悬细胞。

如果起始样本并非血沉棕黄层，请参阅推荐的 PMBC 制备程序。

如需更多技术信息，请联系 Dynal。