本方案适用于阳性磁性分离人外周血单核细胞 (PBMC) 中的 CD3+ T 细胞。第一步,加入 FlowComp™ 人 CD3 抗体,它将与靶细胞结合。第二步,使用 Dynabeads 捕获已结合特异性抗体的 CD3+ T 细胞。第三步也是最后一步,Dynabeads 释放细胞。
下游应用
分离的细胞不含微珠,可以直接用于任何下游应用(包括流式细胞分析)。在 Dynabeads CD3/CD28 T 细胞扩增剂(Invitrogen Dynal 货号 111.31D/111.32D)的作用下,细胞可以轻松增殖,这可通过掺入 EdU(例如 EdU Click-iT,Invitrogen 货号 A10202)或用 CFSE 检测试剂盒(Invitrogen 货号34554)进行测定。 请参阅推荐产品和方案。
所需的其他材料
不包含但执行整个方案需要的材料:
- 分离缓冲液:添加了 0.1% BSA 和 2mM EDTA 且不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS)(例如 Invitrogen Gibco 货号14190)。BSA 可用人血清白蛋白 (HSA) 或 2% FBS/FCS 代替。
- 兼具倾斜和旋转功能的混合器。
- Dynal 磁铁:请参阅磁铁建议。
- 可选:流式细胞分析抗体试剂。Invitrogen 建议将 CALTAG 的抗 CD3 克隆体 UCHT-1 作为荧光一抗,用于分离后的细胞流式染色(可与不同荧光染料偶联,例如 Invitrogen 货号 CD0304)。可选克隆体:OKT3、HITa3。请参阅推荐产品和方案
- 可选:对于活力分析,建议使用 SYTOX Red(Invitrogen 货号 S34859)。
重要提示
- 使用可以倾斜和旋转试管的混合器,确保 Dynabeads 不会沉淀在试管中。
- 使用前,在小瓶中小心地重悬 Dynabeads,即旋晃 >30 秒或倾斜并旋转5分钟。本产品不可与 Dynal MPC™-1(Invitrogen Dynal 货号 120.01D)配合使用
- 移液时,避免出现气泡。
- 切勿使用少于推荐体积的 Dynabeads。
- 请小心遵循推荐的移液体积和孵育时间。
- 让所有缓冲液保持低温
在正常献血者的 PBMC 中,约有 60-70% 的细胞表达 CD3。本方案描述了使用 Dynabeads FlowComp™ 人 CD3 从 5 × 10
7 个 PBMC 中磁性捕获和分离高纯度 CD3
+ T 细胞的步骤。当处理的细胞少于 5 × 10
7 个时,请使用以下所示的体积。处理更多细胞时,请相应增加所有试剂体积和总体积。
制备- 按标准程序分离抗凝外周血或富含白细胞的血沉棕黄层中的 PBMC(有关更多信息,请参阅技术建议)。
- 用分离缓冲液制备浓度为 1 × 108 个细胞/mL 的单细胞悬液。
- 每 5 × 107 个细胞制备约 10 mL 分离缓冲液。
分离程序
室温 (RT) 下的所有孵育也可以在 2-8°C 下进行。
- 从上述悬液中取 500 μL(5 x 107 个细胞),重悬并加入 25 μL FlowComp™ 人 CD3 抗体。
- 混合均匀并在 2-8°C 下孵育10分钟。
- 加入 2 mL 分离缓冲液来洗涤细胞,然后以 350 × g 的速度离心8分钟。
- 去除并丢弃上清液。
- 向细胞团块中加入 1 mL 分离缓冲液并重悬。
- 加入 75 μL 重悬后的 FlowComp™ Dynabeads 并混合均匀。
- 在室温下,以滚动、倾斜的方式孵育15分钟。
- 将试管放在磁铁上至少1分钟。小心地去除并丢弃上清液。
- 从磁铁中取出试管。加入至少 1 mL 分离缓冲液,并通过轻轻吹打5次来重悬微珠结合细胞。
- 将试管放在磁铁上至少1分钟。小心地去除并丢弃上清液。
- 从磁铁中取出试管并在 1 mL FlowComp™ 释放缓冲液中小心地重悬微珠结合细胞。
- 在室温下,以滚动、倾斜的方式孵育10分钟。
- 吹打10次以混匀细胞,然后将试管放入磁铁1分钟。
- 将含有无微珠细胞的上清液转移到新试管中,再将该试管放在磁铁上1分钟以去除任何残留的微珠。
- 将含有无微珠细胞的上清液转移到新试管中。
- 加入 2 mL 分离缓冲液,然后以 350 x g 的速度离心8分钟。
- 丢弃上清液并在首选培养基中重悬细胞团块。
在 2-8°C 下保存细胞,直至进一步用于下游应用。
一般疑难解答
为避免在流式染色过程中非特异性标记细胞,我们建议在荧光一抗染色前先使用丙种球蛋白。
要获得更高的纯度,请重复洗涤步骤一次或将微珠结合细胞转移到新试管中,然后再加入
FlowComp™ 释放缓冲液
从血沉棕黄层制备 PBMC
这种方法得到的血小板数量较低,因此建议与 Dynabeads FlowComp™ 产品配合使用。
- 在 18-25°C 下,使用含 0.1% BSA + 0.6% 柠檬酸钠或 2 mM EDTA 的 PBS 将 10-18 mL 血沉棕黄层稀释至总体积为 35 mL。
- 在 15 mL Lymphoprep™ 上添加稀释后的血沉棕黄层。
- 在 20°C 下,以 160 × g 的速度离心20分钟。在不使用制动器的情况下让其减速。
- 移除 20 mL 上清液以去除血小板。
- 在 20°C 下,以 350 × g 的速度离心20分钟。在不使用制动器的情况下让其减速。
- 从血浆/Lymphoprep™ 分界面回收 PBMC 并将细胞转移至 50 mL 试管中。
- 在 2-8°C 下,使用含 0.1% BSA 的 PBS 通过以 400 × g 的速度离心8分钟的方式洗涤 PBMC 一次。
- 在 2-8°C 下,使用含 0.1% BSA 的 PBS 通过以 225 x g 的速度离心8分钟的方式再洗涤 PBMC 一次,然后以 1 x 108 个 PBMC/mL 的浓度在含 0.1% BSA 的 PBS 中重悬细胞。
如果起始样本并非血沉棕黄层,请参阅推荐的 PMBC 制备程序。
如需更多技术信息,请联系 Dynal。
Invitrogen Dynal AS 符合质量体系标准 ISO 9001:2000 和 ISO 13485:2003。
材料描述
Dynabeads FlowComp™ 是均匀的超顺磁性微珠(直径 2.8 μm)。以 pH 7.4、含 0.1% 牛血清白蛋白 (BSA) 和 0.02% 叠氮化钠 (NaN
3)(作为防腐剂)的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 的形式提供,浓度约为 1 × 10
9 个微珠 (10 mg)/mL。
储存/稳定性
如在未开封的情况下储存于 2-8°C 下,在标签上注明的失效日期前,本产品可一直保持稳定。请在 2-8°C 下储存已开封的小瓶并避免细菌污染。在储存期间和所有操作步骤中,始终让 Dynabeads 处于悬浮液中,因为干燥会导致性能降低。使用前,请充分重悬。
警告和限制
本产品仅用于研究目的。除非另有说明,否则不得用于任何动物或人的治疗或诊断。请遵循适当的实验室指南。本产品含有 0.02% 叠氮化钠(作为防腐剂,具有细胞毒性)。
不要用嘴吹打!
叠氮化钠可与铅和铜管发生反应,形成极易爆炸的金属叠氮化物。通过管道排放进行处置时,请用大量水冲洗,以防止叠氮化物积聚。分析证书 (CoA) 可应要求提供。材料安全数据表 (MSDS) 可在
获得。
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