介绍

本产品适用于从人骨髓、外周血或脐带血中的单核细胞 (MNC) 中阳性磁性分离 CD34+ 细胞。第一步，利用 Dynabeads® 捕获 CD34+ 细胞并使用 Dynal® 磁铁进行分离。第二步，从细胞中去除微珠

下游应用

分离的细胞不含微珠和抗体，表型未发生改变，适合任何下游应用，包括流式细胞分析、功能研究和细胞培养。有关推荐产品和方案，请访问免疫学研究指南。 

材料描述

提供的材料

Dynabeads® CD34 是均匀的超顺磁性聚合物微珠（直径 4.5 μm），包被了对主要在人造血祖细胞和内皮祖细胞上表达的 CD34 膜抗原具有特异性的单克隆一抗。Dynabeads® CD34 以含有 0.1% BSA 和 0.02% NaN3 的 PBS 的形式提供。DETACHaBEAD CD34 是一种多克隆抗 Fab 抗体，对 Dynabeads® CD34 上的 CD34 抗体具有特异性。

所需的其他材料

不包含但执行整个方案需要的材料：


备注：

  • BSA 可用人血清白蛋白 (HSA) 或 FCS 代替。
  • 抗凝剂：0.6% 柠檬酸盐或 2 mM EDTA。

 

方案

本方案描述了从起始浓度为 4 x 10 7 - 1 x 10 8 个 MNC/mL 的 1 mL MNC 中分离 CD34 + 细胞的步骤。使用 4 x 10 7 (100 μL) Dynabeads® CD34；如要增加细胞数量，请相应调整体积。

Dynabeads® 洗涤程序

使用前，应先洗涤 Dynabeads®。

  1. 在小瓶中重悬 Dynabeads®。

  2. 将所需体积的 Dynabeads® 转移至试管中。

  3. 加入相同体积或至少 1 mL 的缓冲液并混合。

  4. 将试管放入磁铁1分钟并丢弃上清液。

  5. 从磁铁中取出试管，在体积与 Dynabeads® 初始体积（第2步）相同的缓冲液中重悬洗过的 Dynabeads®。

样本制备

按照正常程序制备 MNC 悬液。务必使用新鲜样本。处理脐带血或骨髓样本时，建议进行 DNase 处理：有关样本制备的详细信息，请访问 www.invitrogen.com/cellisolation 并点击我们的快速链接。

细胞分离的关键步骤

  • 使用可以倾斜和旋转试管的混合器，确保 Dynabeads® 不会沉淀在管底。
  • 孵育 Dynabeads® 和细胞时，孵育温度必须介于 2-8°C 之间，以减少吞噬活性和其他代谢过程。
  • 不建议使用含 Ca2+ 或 Mg2+ 的 PBS，除非 DNase 处理时需要使用。

分离程序

  1. 使用窄口移液器充分重悬制备好的细胞样本。

  2. 向制备的样本中加入 100 μL Dynabeads® 并旋晃 2-3 秒。

  3. 在 2-8°C 下孵育30分钟，同时轻轻倾斜和旋转试管。

  4. 向试管中注入低温缓冲液直至达到磁铁的高度（或至少 1 mL），然后重悬细胞-微珠复合物。

  5. 将试管放入磁铁2分钟并丢弃上清液。

  6. 通过旋晃或吹打在 2 mL 缓冲液中重悬微珠结合细胞。在磁铁上分离1分钟。

  7. 重复第6步两次。

  8. 在 100 μL 缓冲液中重悬微珠结合细胞。

    9. 分离程序

    对于分离程序，可在室温下保存试管和缓冲液。

  9. 添加 100 μL DETACHaBEAD。（切勿使用少于 100 μL 的 DETACHaBEAD。）

    在室温下孵育45分钟，同时倾斜和旋转试管。（注：使样本留在管底）。

  10. 加入 2 mL 缓冲液并旋晃 2-3 秒，以加快微珠与细胞的分离。

  11. 将试管放入磁铁2分钟。

  12. 将含有已释放细胞的上清液转移到新试管中。要获得剩余细胞，在 500 μL 缓冲液中洗涤微珠3次，然后合并上清液。

  13. 在 10 mL 缓冲液中重悬细胞，借此彻底洗涤细胞。以 400 x g 的速度离心10分钟以去除过量的 DETACHaBEAD。

  14. 在缓冲液或培养基中重悬细胞。

  15. 分离的细胞是纯净的活细胞，表面没有结合抗体，可用于任何下游应用。

基本信息

Invitrogen Dynal® AS 符合质量体系标准 ISO 9001:2000 和 ISO 13485:2003。

储存/稳定性

如在未开封的情况下储存于 2-8°C 下，在标签上注明的失效日期前，本产品可一直保持稳定。请在 2-8°C 下储存已开封的小瓶并避免细菌污染。在储存期间和所有操作步骤中，始终让 Dynabeads® 处于悬浮液中，因为干燥会导致性能降低。使用前，请充分重悬。

警告和限制

本产品仅用于研究目的。除非另有说明，否则不得用于任何动物或人的治疗或诊断。请遵循适当的实验室指南。本产品含有 0.02% 叠氮化钠（作为防腐剂，具有细胞毒性）。

不要用嘴吹打！

叠氮化钠可与铅和铜管发生反应，形成极易爆炸的金属叠氮化物。通过管道排放进行处置时，请用大量水冲洗，以防止叠氮化物积聚。分析证书 (CoA) 可应要求提供。材料安全数据表 (MSDS) 可在 获得。

参考文献

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113.01D.indd   版本003     2007年5月5日

仅供科研使用，不可用于诊断目的。