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本产品旨在通过去除 B 细胞、NK 细胞、单核细胞、血小板、树突状细胞、粒细胞和红细胞，从外周血单核细胞 (PBMC) 中分离未接触的人 T 细胞。分离的 T 细胞无微珠和抗体，适用于任何下游应用。
分离原理
向起始样本中加入抗非 T 细胞的小鼠 IgG 抗体混合物。加入 Depletion Dynabeads，它们将在短暂的孵育过程中结合抗体标记细胞。随后，在磁铁上分离微珠结合细胞并丢弃。剩余的未接触人 T 细胞可用于任何应用。
下游应用
分离的 T 细胞可以在流式细胞分析中分析并用于任何下游应用，例如 T 细胞培养、T 细胞活化与扩增、功能性试验、分子研究。
样本制备
从 PBMC 悬浮液中分离未接触的 T 细胞。我们建议使用会得到较少血小板的样本制备程序。 有关推荐的样本制备程序，请参阅技术建议或访问泛小鼠 IgG - 去除或阳性分离不同物种的细胞。
所需的其他材料
- 兼具倾斜和旋转功能的混合器。
- DynaMag™ 磁铁：有关磁铁建议，请参阅适合分子和细胞分离应用的磁铁。
- 分离缓冲液：添加了 0.1% BSA 和 2mM EDTA 且不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（例如 Gibco 货号14190-094）。
- 热灭活胎牛血清 (FBS)/胎牛血清 (FCS)。
- 用于制备 PBMC 的 Lymphoprep（Axis Shield PoC，挪威）。
备注：
- 让缓冲液保持低温。
- BSA 可用人血清白蛋白 (HSA) 或 2% FBS/FCS 代替。
- EDTA 可用 0.6% 柠檬酸钠代替。
- 不建议使用含 Ca2+ 或 Mg2+ 的 PBS。
重要提示
- 使用前，应先洗涤 Depletion Dynabeads（请参阅“Dynabeads 洗涤程序”）
- 使用可以倾斜和旋转试管的混合器，确保 Dynabeads 不会沉淀在试管中
- 本产品不可与 Dynal MPC™-1（货号120.01D）配合使用。
- 请遵循推荐的体积和孵育时间。
- 移液时，避免出现气泡
Dynabeads 洗涤程序
制备
制备 PBMC 悬浮液（血小板数量低，请参阅技术建议）。在分离缓冲液中以 1 x 10 8 个 PBMC/mL 的浓度重悬悬浮液。
分离程序
本方案基于 5 x 10 7 个 PBMC，可以根据表1从 1 x 10 7 扩展到 5 x 10 8 个细胞。
备注：小规模/中规模/大规模方案的体积差异是为了在有微珠的情况下进行孵育时达到良好的工作体积。
- 在小瓶中重悬 Dynabeads。
- 将所需体积的 Dynabeads 转移至试管中。
- 加入相同体积或至少 1 mL 的分离缓冲液并混合。
- 将试管放入磁铁1分钟并丢弃上清液。
- 从磁铁中取出试管，在体积与 Dynabeads 初始体积（第2步）相同的分离缓冲液中重悬洗过的 Dynabeads。
制备
制备 PBMC 悬浮液（血小板数量低，请参阅技术建议）。在分离缓冲液中以 1 x 10 8 个 PBMC/mL 的浓度重悬悬浮液。
分离程序
本方案基于 5 x 10 7 个 PBMC，可以根据表1从 1 x 10 7 扩展到 5 x 10 8 个细胞。
| 每 1 x 107 个 PBMC 的体积 | 每 5 x 107 个 PBMC 的体积 | 每 5 x 108 个 PBMC 的体积 | |
|---|---|---|---|
| 试管尺寸 | 3-5 mL | 15 mL | 50 mL |
| 细胞体积（第1步） | 100 μL | 500 μL | 5 mL |
| FBS/FCS（第2步） | 20 μL | 100 μL | 1 mL |
| 抗体混合物（第3步） | 20 μL | 100 μL | 1 mL |
| 洗涤（第5步） | 2 mL | 5 mL | 40 mL |
| 重悬（第6步） | 100 μL | 500 μL | 5 mL |
| Depletion Dynabeads（第7步） | 100 μL | 500 μL | 5 mL |
| 磁性分离前 加入的体积（第10步） | 1 mL | 5 mL | 20 mL |
备注：小规模/中规模/大规模方案的体积差异是为了在有微珠的情况下进行孵育时达到良好的工作体积。
- 将分离缓冲液中的 500 μL (5 x 107) PBMC 转移至试管中。
- 加入 100 μL 热灭活 FCS。
- 加入 100 μL 抗体混合物。
- 混合均匀并在 2-8°C 下孵育20分钟。
- 加入 5 mL 分离缓冲液来洗涤细胞。倾斜试管几次以混合均匀，并在 2-8°C 下以 300 x g 的速度离心8分钟。丢弃上清液。
- 在 500 μL 分离缓冲液中重悬细胞。
- 加入 500 μL 经过预洗涤的 Depletion Dynabeads。
- 在 18-25°C 下孵育15分钟，同时轻轻倾斜和旋转试管。
- 使用窄口移液器（如 1,000 μL 移液器吸头或 5 mL 血清移液器）轻轻吹打5次来重悬微珠结合细胞。
- 加入 5 mL 分离缓冲液。（在有微珠的情况下进行孵育时，如果处理 < 1 x 107 个 PBMC，则加入总体积至多为 1 mL 的分离缓冲液）。
- 将试管放入磁铁2分钟。
- 将上清液转移到新试管中。
- 重复第 10-12 步。
- 如需去除任何残留的 Dynabeads，将试管放入磁铁2分钟，然后将上清液转移至新试管中。上清液含有阴性分离的人 T 细胞。
样本制备
从血沉棕黄层制备 PBMC 以获得较低数量的血小板：
从血沉棕黄层制备 PBMC 以获得较低数量的血小板：
- 在 18-25°C（室温）下，使用 PBS 分离缓冲液将 10-15 mL 血沉棕黄层稀释至总体积为 35 mL。
- 在 15 mL Lymphoprep 上添加稀释后的血沉棕黄层。
- 在室温下以 160 x g 的速度离心20分钟。在不使用制动器的情况下让其减速。
- 移除 18-20 mL 上清液以去除血小板。
- 在室温下以 350 x g 的速度离心20分钟。在不使用制动器的情况下让其减速。
- 从血浆/Lymphoprep 分界面回收 PBMC 并将细胞转移至 50 mL 试管中。
- 在 2-8°C 下，使用分离缓冲液通过以 400 x g 的速度离心8分钟的方式洗涤 PBMC 一次。
- 在 2-8°C 下，使用分离缓冲液通过以 225 x g 的速度离心8分钟的方式洗涤 PBMC 两次，然后以 1 x 108 个 PBMC/mL 的浓度在分离缓冲液中重悬 PBMC。
Invitrogen Dynal AS 符合质量体系标准 ISO 9001:2000 和 ISO 13485:2003。
储存/稳定性
如在未开封的情况下储存于 2-8°C 下，在标签上注明的失效日期前，本产品可一直保持稳定。请在 2-8°C 下储存已开封的小瓶并避免细菌污染。在储存期间和所有操作步骤中，始终让 Dynabeads 处于悬浮液中，因为干燥会导致性能降低。使用前，请充分重悬。
警告和限制
本产品仅用于研究目的。除非另有说明，否则不得用于任何动物或人的治疗或诊断。请遵循适当的实验室指南。本产品含有 0.02% 叠氮化钠（作为防腐剂，具有细胞毒性）。
不要用嘴吹打！
叠氮化钠可与铅和铜管发生反应，形成极易爆炸的金属叠氮化物。通过管道排放进行处置时，请用大量水冲洗，以防止叠氮化物积聚。分析证书 (CoA) 可应要求提供。材料安全数据表 (MSDS) 可在 获得。
储存/稳定性
如在未开封的情况下储存于 2-8°C 下，在标签上注明的失效日期前，本产品可一直保持稳定。请在 2-8°C 下储存已开封的小瓶并避免细菌污染。在储存期间和所有操作步骤中，始终让 Dynabeads 处于悬浮液中，因为干燥会导致性能降低。使用前，请充分重悬。
警告和限制
本产品仅用于研究目的。除非另有说明，否则不得用于任何动物或人的治疗或诊断。请遵循适当的实验室指南。本产品含有 0.02% 叠氮化钠（作为防腐剂，具有细胞毒性）。
不要用嘴吹打！
叠氮化钠可与铅和铜管发生反应，形成极易爆炸的金属叠氮化物。通过管道排放进行处置时，请用大量水冲洗，以防止叠氮化物积聚。分析证书 (CoA) 可应要求提供。材料安全数据表 (MSDS) 可在 获得。
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113.44D.indd 版本001 2008年5月5日
仅供科研使用，不可用于诊断目的。