介绍

使用 Dynabeads CD31 直接从制备的组织消化物中分离或去除 CD31+ 人微血管内皮细胞。本产品还可用于重新选择培养中生长的内皮细胞。分离的细胞适合进行细胞培养或分子分析。Dynabeads CD31 将结合人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)。已经从许多人组织中分离出微血管内皮细胞，包括脂肪、大脑、皮肤、子宫内膜、胃、心脏、肠道、肝脏、肺、胎盘、肾、滑膜和扁桃体组织。CD31 在所有内皮细胞以及血小板和白细胞上表达，如单核细胞、NK 细胞、粒细胞、B 细胞和 T 细胞亚群。因此，Dynabeads CD31 不能直接用于全血或骨髓样本。

分离原理

Dynabeads 与试管中的细胞样本混合。Dynabeads 将在短暂的孵育过程中结合靶细胞，然后用磁铁分离 微珠结合 细胞。

阳性分离 - 丢弃上清液并将微珠结合细胞用于下游应用。经过 阳性 分离 的内皮细胞是纯净、存活且未受刺激的细胞，非常适合在 Dynabeads 仍然粘附的情况下进行培养。这样可避免成纤维细胞、周细胞或平滑肌细胞污染。细胞将良好生长并 正常 粘附 ，大约传代三次后，稀释掉所有微珠。 

去除 - 丢弃微珠结合细胞并将剩余的未接触细胞用于任何应用。

材料描述

Dynabeads CD31 是均匀的超顺磁性聚苯乙烯微珠（直径 4.5 μm），包被了对 CD31 细胞表面抗原 PECAM-1（血小板内皮细胞粘附分子-1）具有特异性的小鼠 IgG1 单克隆抗体。CD31 一抗通过二抗粘附到 Dynabeads 上，以确保一抗具有较佳方向。Dynabeads 上的二抗是人 IgG4 抗小鼠 IgG。人单克隆抗体的来源不含人免疫缺陷病毒 (HIV)、乙肝病毒 (HBV) 以及丙肝病毒 (HCV)。

提供的材料

  • 5 mL Dynabeads CD31  -  以 pH 7.4、含 0.1% 牛血清白蛋白 (BSA) 和 0.02% 叠氮化钠 (NaN3) 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 的形式提供，浓度为 4 x 108 个微珠/mL。产品足以进行200次检测，其中，一次检测定义为 1 mL 细胞重悬至 1 x 108 个细胞/mL 的密度。
  • 本产品将处理多达 2 x 1010 个细胞。


所需的其他材料

 

方案

Dynabeads 洗涤程序

使用前，应先洗涤 Dynabeads。

  1. 在小瓶中重悬 Dynabeads。

  2. 将所需体积的 Dynabeads 转移至试管中。

  3. 加入相同体积或至少 1 mL 的缓冲液1并混合。

  4. 将试管放入磁铁1分钟并丢弃上清液。

  5. 从磁铁中取出试管，在体积与 Dynabeads 初始体积（第2步）相同的缓冲液1中重悬洗过的 Dynabeads。


用不同组织制备单细胞悬液（见参考文献）

  • 脂肪组织：1、2、3和4
  • 血液：5、6和7
  • 骨髓：8、9、10和11
  • 大脑组织：12、13、14和15
  • 皮肤组织：16、17、18和19
  • 子宫内膜组织：20
  • 胃组织：21和22
  • 心脏组织：23、24和25
  • 人脐带静脉内皮细胞 (HUVEC)：16、26和27
  • 肠道组织：21和22
  • 肝脏组织：28
  • 肺组织：29、30和31
  • 胎盘组织：32和33
  • 肾组织：34
  • 滑膜组织：16、35
  • 扁桃体组织：36


有关推荐的样本制备程序，请访问泛小鼠 IgG - 去除或阳性分离不同物种的细胞并点击我们的快速链接。  

细胞分离

细胞分离的关键步骤

  • 使用可以倾斜和旋转试管的混合器，确保 Dynabeads 不会沉淀在管底。
  • 孵育 Dynabeads 和细胞时，孵育温度必须介于 2-8°C 之间，以减少吞噬活性和其他代谢过程。
  • 对于每 mL 细胞样本，切勿使用少于 25 μL 的 Dynabeads。
  • 细胞浓度可高达 1 x 108 个细胞/mL。


表1： 每 mL 细胞样本添加的 Dynabeads 体积。可以根据需要增加体积。

 阳性分离去除
样本体积
（高达 108 个细胞/mL）
1 mL
1 mL
Dynabeads 体积25 μL50 μL
每份产品处理的
细胞总数
2 x 1010 个细胞
1 x 1010 个细胞


阳性分离或去除单细胞悬液中的内皮细胞

  1. 将适当体积的 Dynabeads 加入制备的单细胞悬液中。有关体积，请参阅表1。

  2. 在 2-8°C 下孵育20分钟（阳性分离）或30分钟（去除），同时轻轻倾斜和旋转试管。

  3. 将试管放入磁铁2分钟。

  4. 如需去除，将上清液转移至新试管中，待进一步使用。

  5. 如需阳性分离，丢弃上清液并洗涤微珠结合细胞3次（洗涤方法：在缓冲液1中重悬至原样本体积），然后使用磁铁进行分离。现在，微珠结合内皮细胞可用于铺板或进一步分析。


为了快速得出一致的蛋白或基因表达分析结果，在 CD31+ 细胞仍附着到微珠时进行裂解，并直接处理以用于进一步分子分析。

从培养物中重新选择微血管内皮细胞

  1. 从生长了内皮细胞的培养皿中移除培养基。

  2. 添加 0.5 mL 缓冲液2（35 mm 皮氏培养皿），在 37°C 下孵育5分钟*，敲击培养皿使细胞脱落（用显微镜检查）。

  3. 添加 2 mL 缓冲液3（用于中和胰蛋白酶）。

  4. 离心洗涤一次并在缓冲液1中将内皮细胞重悬至 <2 x 106/mL 的浓度。

  5. 为每 mL 细胞悬液添加 25 μL 洗后的 Dynabeads。

  6. 在 2-8°C 下孵育20分钟，同时轻轻倾斜和旋转试管。

  7. 添加缓冲液1，使体积为原体积的两倍，然后将试管放入磁铁2分钟。

  8. 丢弃上清液并洗涤微珠结合细胞3次（洗涤方法：在缓冲液1中重悬至丢弃的体积），然后使用磁铁进行分离。

  9. 现在，微珠结合内皮细胞可用于铺板或进一步分析。


* 使用胰蛋白酶/EDTA 进行孵育的时间可以按照用户需求适当改变。

使用 Dynabeads 去除非内皮细胞

请参阅参考文献11和36

基本信息

Invitrogen Dynal AS 符合质量体系标准 ISO 9001:2000 和 ISO 13485:2003。

储存/稳定性

如在未开封的情况下储存于 2-8°C 下，在标签上注明的失效日期前，本产品可一直保持稳定。请在 2-8°C 下储存已开封的小瓶并避免细菌污染。在储存期间和所有操作步骤中，始终让 Dynabeads 处于悬浮液中，因为干燥会导致性能降低。使用前，请充分重悬。

警告和限制

本产品仅用于研究目的。除非另有说明，否则不得用于任何动物或人的治疗或诊断。请遵循适当的实验室指南。本产品含有 0.02% 叠氮化钠（作为防腐剂，具有细胞毒性）。

不要用嘴吹打！

叠氮化钠可与铅和铜管发生反应，形成极易爆炸的金属叠氮化物。通过管道排放进行处置时，请用大量水冲洗，以防止叠氮化物积聚。分析证书 (CoA) 可应要求提供。材料安全数据表 (MSDS) 可在 获得。

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