人 Treg 细胞的活化和扩增

本方案旨在活化和扩增使用 Dynal CD4 ⁺CD25 ⁺ Treg 试剂盒（货号 113.23D）分离的人 Treg 细胞。扩增的 Treg 细胞保留了调节能力 (1-3)。

扩增原理

Dynabeads 人 Treg 扩增剂提供了一种不需要抗原呈递细胞或抗原即可扩增 Treg 细胞的简单方法。只需在 Treg 培养物中加入 Dynabeads 人 Treg 扩增剂和重组 IL-2 (rIL-2) 即可扩增 Treg 细胞。出现耗竭迹象的细胞培养物可通过加入新鲜微珠和 rIL-2 来重新刺激。

即用型 Dynabeads 人 Treg 扩增剂提供了首批人工抗原呈递细胞，可同时向 TCR/CD3 和 CD28 提供信号，从而充分活化和扩增人 Treg 细胞。

材料描述

Dynabeads 人 Treg 扩增剂是均匀的 4.5 μm 超顺磁性聚苯乙烯微珠，包被了抗人 T 细胞 CD3 和 CD28 细胞表面分子的单克隆抗体的优化混合物。Dynabeads 人 Treg 扩增剂上包被的 CD3 抗体对人 CD3 的 ε 链（TCR 复合物的亚基）具有特异性。CD28 抗体对人 CD28 共刺激分子具有特异性，该分子是 CD80 (B7-1) 和 CD86 (B7-2) 的受体。两种抗体都偶联相同微珠，模拟抗原呈递细胞 体内刺激。

提供的材料

• 2 mL Dynabeads 人 Treg 扩增剂
• 以 pH 7.4、含 0.1% 人血清白蛋白 (HSA) 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 的形式提供，浓度为 2 x 10⁷ 个微珠/mL。

所需的其他材料

不包含但执行整个方案需要的材料：

• 磁铁：任何 Dynal MPC™
• 缓冲液1：含 0.1% BSA 的 PBS，pH 7.4
• 培养基：旨在支持人 T 细胞的培养和扩增的 OpTmizer™ T 细胞扩增 SFM (Gibco) 无血清 1X 配方（或等效培养基）
• 尺寸合适的圆底组织培养板或组织培养瓶
• 加湿的 CO₂ 培养箱
• Dynal CD4⁺CD25⁺ Treg 试剂盒（货号 113.23D）
• rIL-2

技术建议

通常建议使用 4:1 的微珠与细胞比以及表1中提供的细胞浓度。针对特定应用进行优化后，可使用其他微珠与细胞比和细胞浓度。纯度至少为 95% 的 Treg 细胞将提供最佳的扩增结果。低纯度可使 CD8 ⁺ 和 CD4 ⁺CD25- T 细胞生长并相对减少 Treg 细胞数。

如果纯度低于上述推荐值，扩增结果可能欠佳。为了改善扩增结果，可将 IL-2 含量至多增加到 1000 U/mL rIL-2。

Dynabeads 洗涤程序

使用前，应借助磁铁洗涤 Dynabeads。

  1.   在小瓶中重悬 Dynabeads。

  2.   将所需体积的 Dynabeads 转移至试管中。

  3.   加入体积与 Dynabeads 初始体积相同或至少 1 mL 的缓冲液1并混合。

  4.   将试管放入磁铁 1-2 分钟，直至 Dynabeads 分离；丢弃上清液。从磁铁中取出试管。

  5.   在体积与 Dynabeads 初始体积相同的缓冲液1中重悬洗过的 Dynabeads。

表1


分离人 Treg 细胞

如要分离人 Treg 细胞，建议使用 Dynal CD4 ⁺CD25 ⁺ Treg 试剂盒（货号 113.23D）。

扩增人 Treg 细胞第0天：

从圆底96孔组织培养板中的 100 μL 培养基中的 1 x 10 ⁵ 个 Treg 细胞开始。
加入 20 μL Dynabeads 人 Treg 扩增剂。
加入 500 U/mL rIL-2。

第1天：

加入 100 μL 培养基（含
500 U/mL rIL-2）。

第3天：

重悬培养物并将其一分为二，然后在每个孔中加入 100 μL 培养基（含
500 U/mL rIL-2）。

第 5-7 天：

根据需要分开培养物。每日检查培养物，注意细胞大小和形状。在耗竭的细胞培养物中，通常会观察到细胞缩小和增殖速率下降。充分重悬后，每周进行至少两次细胞计数。

当细胞密度超过 2 x 10 ⁶ 个细胞/mL 或培养基变黄时，将培养物分开，使细胞在含有 500 U/mL rIL-2 的培养基中的密度为 0.5-1.0 x 10 ⁶ 个细胞/mL。培养细胞，直至孔半满（~500,000 个细胞），然后将细胞从96孔板转移至24孔板中。

第8天：

重悬细胞并将细胞转移至合适的试管中，借此去除 Dynabeads。将试管放入磁铁 1-2 分钟，直至 Dynabeads 分离。离心上清液并在含 100 U/mL rIL-2 的新鲜培养基中重悬细胞团块。按需分开培养物，在含 100 U/mL rIL-2 的培养基中静置细胞，直至第 21-24 天。在 37°C 下，用加湿的 CO2 培养箱孵育细胞。

重新刺激人 Treg 细胞

第一次刺激后 15-18 天或观察到细胞缩小和增殖速率下降时，可以重新刺激细胞。有关重新刺激的指南见表2。

在重新刺激前：

  1.   进行细胞计数并分开培养物，使其在培养基中的密度为 1 x 10 ⁶ 个细胞/mL。

  2.   使用表2中提供的体积并按照以下方案进行操作。

第0天：

  1.   从24孔组织培养板中的 1 mL 培养基中的 1 x 10 ⁶ 个 Treg 细胞开始。

  2.  加入 50 μL Dynabeads Treg 扩增剂。

  3.  加入 100 U/mL rIL-2。

第1天：

  1.   每个孔加入 100 μL 培养基（含

  2.  100 U/mL rIL-2）。

第2或3天：

  1.  重悬培养物并将其一分为二，然后在每个孔中加入 100 μL 含 100 U/mL rIL-2 的培养基。

第 5-7 天：

1. 根据需要分开培养物。


2. 每日检查培养物，注意细胞大小和形状。在耗竭的细胞培养物中，通常会观察到细胞缩小和增殖速率下降。 


3. 充分重悬后，每周进行至少两次细胞计数。

当细胞密度超过 2 x 10 ⁶ 个细胞/mL 或培养基变黄时，将培养物分开，使细胞在含有 100 U/mL rIL-2 的培养基中的密度为 0.5-1.0 x 10 ⁶ 个细胞/mL。

第8天：

  1.   重悬细胞并将细胞转移至合适的试管中，借此去除 Dynabeads。

  2.   将试管放入磁铁 1-2 分钟，直至 Dynabeads 分离。

  3.  离心上清液并在含 100 U/mL rIL-2 的新鲜培养基中重悬细胞团块。

  4.  按需分开培养物，在含 100 U/mL rIL-2 的培养基中静置细胞，直至第 21-24 天。

表2



用于鉴别扩增 Treg 细胞抑制能力的混合淋巴细胞反应 (MLR) 检测

1. 分离树突状细胞并用 TNF-a 和 LPS 培养2天，然后在用作 MLR 中的刺激剂前进行照射。


2. 在96孔 U 形底培养板中建立 5 x 10⁴ 个应答 CD4⁺CD25- T 细胞和 1 x 10⁴ 个经照射同种异体树突状细胞（作为刺激剂）的共培养物。


3. 加入新近纯化或体外扩增的 CD4⁺CD25⁺ Treg 细胞，比例为 1:1、1:4、1:8、1:16 和 1:32（CD25⁺: CD25^- 比）。


4. 第6天，用 ³H-胸苷脉冲标记培养孔，然后在收获前再培养18小时

Invitrogen Dynal AS 符合质量体系标准 ISO 9001:2000 和 ISO 13485:2003。

储存/稳定性

如在未开封的情况下储存于 2-8°C 下，在标签上注明的失效日期前，本产品可一直保持稳定。
请在 2-8°C 下储存已开封的小瓶并避免细菌污染

在储存期间和所有操作步骤中，始终让 Dynabeads 处于悬浮液中，因为干燥会导致性能降低。使用前，请充分重悬。

技术支持

如需更多技术支持，请联系 Invitrogen Dynal AS（请参阅详细联系信息）。

警告和限制

本产品仅用于研究目的。除非另有说明，否则不得用于任何动物或人的治疗或诊断。请遵循适当的实验室指南。

本产品含有 0.02% 叠氮化钠（作为防腐剂，具有细胞毒性）。 不要用嘴吹打！
叠氮化钠可与铅和铜管发生反应，形成极易爆炸的金属叠氮化物。通过管道排放进行处置时，请用大量水冲洗，以防止叠氮化物积聚。

分析证书 (CoA) 可应要求提供。材料安全数据表 (MSDS) 可在 获得。

专利和商标

Dynal、Dynabeads 和 Dynal MPC™ 是 Invitrogen Dynal AS（挪威奥斯陆）的注册商标或商标。此处使用的所有注册或商标符号均表示商标在美国的注册状态。商标可能在也可能不在其他国家/地区注册。

知识产权免责声明

Invitrogen Dynal 概不对使用本公司产品时可能发生的违法行为或专利侵权行为承担责任。