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本方案旨在通过去除非单核细胞（T 细胞、B 细胞、NK 细胞、树突状细胞、红细胞、粒细胞和巨噬细胞），从外周血单核细胞 (PBMC) 中分离未接触的人单核细胞。分离的单核细胞无微珠和抗体，适用于任何下游应用。
分离原理
向起始样本中加入阻断试剂和抗非单核细胞的生物素化单克隆抗体混合物（抗体混合物）。加入 Depletion MyOne SA Dynabeads®，让其在短暂的孵育过程中结合非单核细胞。用磁铁分离微珠结合细胞。丢弃微珠结合细胞并将剩余的未接触人单核细胞用于任何应用。
下游应用
分离的人单核细胞可用于任何应用，例如：细胞培养、生成源于单核细胞的树突状细胞 (Mo-DC)、功能性试验、分子研究和流式细胞分析。有关推荐产品和方案，请访问免疫学研究指南。
所需的其他材料
- 兼具倾斜和旋转功能的混合器。
- 磁铁：请参阅 Dynabeads® mRNA 纯化试剂盒（从总 RNA 制备液中纯化 mRNA）。
- 分离缓冲液：添加了 0.1% BSA 和 2mM EDTA 且不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（例如 Gibco 货号10010-023）。
- Mo-DC 培养基：含 10% 胎牛血清 (FCS) 的 RPMI-1640。
- 热灭活胎牛血清 (FBS)/胎牛血清 (FCS)。
- 用于制备 PBMC 的 Lymphoprep®（Axis Shield PoC，挪威）。
备注：
- BSA 可用人血清白蛋白 (HSA) 或 2% FBS/FCS 代替。
- EDTA 可用 0.6% 柠檬酸钠代替。
- 不建议使用含 Ca2+ 或 Mg2+ 的 PBS。
重要提示
- 使用前，应先洗涤 Dynabeads®（请参阅 Dynabeads® 洗涤程序）。
- 使用可以倾斜和旋转试管的混合器，确保 Dynabeads® 不会沉淀在试管中。
- 务必按推荐次数用力吹打，以防单核细胞滞留在微珠结合细胞部分。移液时，尽量避免出现气泡。
- 请遵循推荐的体积和孵育时间。（切勿使用少于推荐体积的 Dynabeads®）
- 在处理单核细胞时，务必让细胞和缓冲液保持低温。
Dynabeads® 洗涤程序
使用前，应先洗涤 Dynabeads®。
- 在小瓶中重悬 Dynabeads®。（即旋晃 >30 秒或倾斜并旋转5分钟。）
- 将所需体积的 Dynabeads® 转移至试管中。
- 加入相同体积或至少 1 mL 的分离缓冲液并混合。
- 将试管放入磁铁1分钟并丢弃上清液。
- 从磁铁中取出试管，在体积与 Dynabeads® 初始体积（第2步）相同的分离缓冲液中重悬洗过的 Dynabeads®
制备 PBMC
- 按照推荐的样本制备方案（血小板数量低）制备 PBMC 悬浮液。 有关推荐的样本制备程序，请访问泛小鼠 IgG - 去除或阳性分离不同物种的细胞并点击我们的快速链接。
- 在分离缓冲液中以 1 x 108 个 PBMC/mL 的浓度重悬悬浮液。
分离程序
本方案基于 5 × 107 个 PBMC，可以根据表1从 1 × 107 扩展到 5 × 108 个细胞。
表1. 适用于人单核细胞分离的体积
| 每 5 x 107 个 PBMC 的工作体积 | 每 5 x 108 个 PBMC 的工作体积 | |
|---|---|---|
| 试管尺寸 | 15 mL | 50 mL |
| 细胞体积（第1步） | 500 μL | 5 mL |
| FBS/FCS（第2步） | 100 μL | 1 mL |
| 抗体混合物（第3步） | 100 μL | 1 mL |
| 洗涤（第5步） | 10 mL | 40 mL |
| 重悬（第6步） | 500 μL | 5 mL |
| Depletion MyOne Dynabeads®（第7步） | 500 μL | 5 mL |
| 磁性分离前 加入的体积（第10步）* | 5 mL | 20 mL |
* 请注意，小规模与大规模方案的体积有所不同是为了在有微珠的情况下进行孵育时达到良好的工作体积。可以在处理的任何细胞水平上从小规模切换成大规模参数，只要得到的体积在有微珠的情况下进行孵育时适合所用试管就行（超过总试管体积的 1/10）。
- 此方案的起始细胞数量为 5 x 107（有关详情，请参阅上文的制备）
- 保持低温以减少单核细胞损耗。将缓冲液预冷至 2-8°C。
- 将分离缓冲液中的 500 μL (5 x 107) PBMC 转移至试管中。
- 加入 100 μL 阻断试剂。
- 加入 100 μL 抗体混合物。
- 混合均匀并在 2-8°C 下孵育20分钟。
- 加入 10 mL 分离缓冲液来洗涤细胞。倾斜试管几次以混合均匀，并在 2-8°C 下以 350 × g 的速度离心8分钟。丢弃上清液。
- 在 500 μL 分离缓冲液中重悬细胞。
- 加入 500 μL 经过预洗涤的 Depletion MyOne SA Dynabeads®。
- 在 2-8°C 下孵育15分钟，同时轻轻倾斜和旋转试管。
- 使用窄口移液器（如 1000 μL 移液器吸头或 5 mL 血清移液器）用力吹打 >10 次来重悬微珠结合细胞。
- 加入 5 mL 分离缓冲液（在有微珠的情况下进行孵育时，如果工作体积 < 1 mL，则在重悬前加入 1 mL 分离缓冲液）。
- 将试管放入磁铁2分钟。
- 将含有未接触人单核细胞的上清液转移到新试管中。
- 向装有 Dynabeads® 的试管中加入 5 mL 分离缓冲液。
- 通过用力吹打（如第9步所述）重悬微珠结合细胞。
- 将试管放入磁铁2分钟。
- 合并两份上清液。
- 可选： 如需去除残留的微珠，将试管放入磁铁2分钟，然后将细胞转移至新试管中。
Invitrogen Dynal® AS 符合质量体系标准 ISO 9001:2000 和 ISO 13485:2003。
材料描述
Depletion MyOne™ SA Dynabeads® 是均匀的超顺磁性聚苯乙烯微珠（直径 1.0 μm），包被了链霉亲和素 (SA)。抗体混合物含有抗 CD3、CD7、CD16（对 CD16a 和 CD16b 具有特异性）、CD19、CD56、CDw123 和 CD235a（血型糖蛋白 A）的生物素化小鼠 IgG 抗体。以含有 0.5% BSA 和 0.02% 叠氮化钠 (NaN3) 的 PBS 的形式提供。阻断试剂是在 0.9% NaCl 中聚合的 γ 球蛋白。由于浓度高，
γ 球蛋白可能在溶液中沉淀。这不是污染，溶液在混合后可以使用。加入阻断试剂是为了阻断单核细胞上的 FC 受体。
储存/稳定性
如在未开封的情况下储存于 2-8°C 下，在标签上注明的失效日期前，本产品可一直保持稳定。请在 2-8°C 下储存已开封的小瓶并避免细菌污染。在储存期间和所有操作步骤中，始终让 Dynabeads® 处于悬浮液中，因为干燥会导致性能降低。使用前，请充分重悬。
警告和限制
本产品仅用于研究目的。除非另有说明，否则不得用于任何动物或人的治疗或诊断。请遵循适当的实验室指南。本产品含有 0.02% 叠氮化钠（作为防腐剂，具有细胞毒性）。
不要用嘴吹打！
叠氮化钠可与铅和铜管发生反应，形成极易爆炸的金属叠氮化物。通过管道排放进行处置时，请用大量水冲洗，以防止叠氮化物积聚。分析证书 (CoA) 可应要求提供。材料安全数据表 (MSDS) 可在 获得。
材料描述
Depletion MyOne™ SA Dynabeads® 是均匀的超顺磁性聚苯乙烯微珠（直径 1.0 μm），包被了链霉亲和素 (SA)。抗体混合物含有抗 CD3、CD7、CD16（对 CD16a 和 CD16b 具有特异性）、CD19、CD56、CDw123 和 CD235a（血型糖蛋白 A）的生物素化小鼠 IgG 抗体。以含有 0.5% BSA 和 0.02% 叠氮化钠 (NaN3) 的 PBS 的形式提供。阻断试剂是在 0.9% NaCl 中聚合的 γ 球蛋白。由于浓度高，
γ 球蛋白可能在溶液中沉淀。这不是污染，溶液在混合后可以使用。加入阻断试剂是为了阻断单核细胞上的 FC 受体。
储存/稳定性
如在未开封的情况下储存于 2-8°C 下，在标签上注明的失效日期前，本产品可一直保持稳定。请在 2-8°C 下储存已开封的小瓶并避免细菌污染。在储存期间和所有操作步骤中，始终让 Dynabeads® 处于悬浮液中，因为干燥会导致性能降低。使用前，请充分重悬。
警告和限制
本产品仅用于研究目的。除非另有说明，否则不得用于任何动物或人的治疗或诊断。请遵循适当的实验室指南。本产品含有 0.02% 叠氮化钠（作为防腐剂，具有细胞毒性）。
不要用嘴吹打！
叠氮化钠可与铅和铜管发生反应，形成极易爆炸的金属叠氮化物。通过管道排放进行处置时，请用大量水冲洗，以防止叠氮化物积聚。分析证书 (CoA) 可应要求提供。材料安全数据表 (MSDS) 可在 获得。
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- Jarnak-Jankovic S et al (2005) Evaluation of dendritic cells loaded with apoptotic cancer cells or expressing tumour mRNA as potential cancer vaccines against leukemia.BMC Cancer.5:20 doi:10.1186/1471-2407-5-20.
- Monteiro M et al (2007) Cartography of gene expression in CD8 single cells: novel CCR7- subsets suggest differentiation independent of CD45RA expression.Blood.109:2863-2870.
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- Zioza A et al (2003) CD8+ T cells that express CD4 on their surface (CD4dim-CD8bright T cells) recognize an antigenspecific target, are detected in vivo and can be productively infected by T-tropic HIV.Blood 102: 2156-2164.
113.50D.indd 版本003 2008年5月5日
仅供科研使用，不可用于诊断目的。