人 T 细胞的生理活化

本方案适用于人 T 细胞的生理活化，如 CD4+ T 细胞、CD8+ T 细胞、多克隆 T 细胞或抗原特异性 T 细胞

下游应用

活化后不久便可分析活化的 T 细胞（以进行转染/转导或研究，如 TCR 信号传递、蛋白质组学或基因表达）。可以让 T 细胞保持培养状态以分化成辅助性 T 细胞亚群（参考文献1、2、3），也可以进行 T 细胞增殖或多克隆/Ag 特异性 T 细胞扩增（参考文献4、5）。

所需的其他材料

• 缓冲液：含 0.1% 牛血清白蛋白和 2 mM EDTA 的磷酸盐缓冲盐水（如 Invitrogen Gibco 货号 10010-023），pH 7.4（含 0.1% BSA 的 PBS）。

• 磁铁 (DynaMag™)：有关磁铁建议，请参阅适合分子和细胞分离应用的磁铁。 

• 培养基：可使用 Advanced RPMI 培养基1640（Invitrogen Gibco 货号 12633-012），其中含有 2 mM L-谷氨酰胺、10% FCS/FBS 和 100 U/mL 青霉素/链霉素。或者使用含 100 U/mL 青霉素/链霉素的 CTS™ OpTmizer™ T 细胞扩增 SFM（Invitrogen Gibco 货号 A1048501）或等效培养基。

• 热灭活胎牛血清 (FCS)。
• 重组人 IL-2。
• 尺寸合适的平底组织培养板或组织培养瓶。
• 加湿的 CO₂ 培养箱。

重要提示

• 使用前，在小瓶中小心地重悬 Dynabeads™，即旋晃 >30 秒或倾斜并旋转5分钟。
• 本产品不可与 Dynal™ MPC™-1 配合使用。
• 切勿使用低于推荐体积的 Dynabeads™。
• 请小心遵循推荐的移液体积。
• 移液时，避免出现气泡。
• 在流式细胞分析前，应去除 Dynabeads™ 和微珠结合细胞。活化时以及之后的 2-3 天内，一些细胞将强烈结合微珠。通过吹打充分重悬微珠/细胞悬液以提高细胞回收率，在磁铁上（转移到合适试管后）分离并收集含 T 细胞的上清液。微珠结合细胞部分可以过夜培养，重复上述过程可以进一步提高 T 细胞的回收率。将细胞用于蛋白质组学或基因表达研究时，在去除微珠前先裂解细胞。

使用本产品可轻松实现人 T 细胞的生理活化，无需制备抗原呈递细胞 (APC) 或抗原。

制备

• 有关建议用于阳性或阴性分离所有人 T 细胞或特定 T 细胞亚群的 Dynabeads™ 产品，请参阅泛小鼠 IgG - 去除或阳性分离不同物种的细胞。 按照各自包装说明书中所述的步骤进行操作。
• 制备细胞培养基。

Dynabeads™ 洗涤程序 

使用前，应先洗涤 Dynabeads™。

1. 在小瓶中重悬 Dynabeads™ 人 T 活化剂 CD3/CD28。


2. 将所需体积的 Dynabeads™ 转移至试管中。


3. 加入相等体积或至少 1 mL 的缓冲液并混合（旋晃5秒或放在滚筒上至少5分钟）。


4. 将试管放在磁铁上1分钟并丢弃上清液。


5. 从磁铁上取下试管，在体积与从小瓶中取出的 Dynabeads™ 初始体积（第2步）相同的培养基中重悬洗过的 Dynabeads™。

人 T 细胞活化

1. 从96孔组织培养板中的 100-200 μL 培养基中的 8 x 10⁴ 个纯化 T 细胞开始。


2. 加入 2 μL Dynabeads™ 人 T 活化剂 CD3/CD28，使微珠与细胞比达到 1:1（见表1）。


3. 按照特定的实验要求，在 37°C 下用加湿的 CO₂ 培养箱孵育细胞。


4. 收获活化的 T 细胞并直接用于进一步分析。


5. 对于流式细胞分析应用，在染色前请去除微珠。将试管放在磁铁上 1-2 分钟以从溶液中分离微珠。将含有细胞的上清液转移到新试管中。

人 T 细胞扩增

1. 从合适组织培养板或组织培养瓶中的培养基中的纯化 T 细胞（密度为 1-1.5 x 10⁶ 个/mL）开始。


2. 按 1:1 的微珠与细胞比加入 Dynabeads™ 人 T 活化剂 CD3/CD28（见表1）。


3. 加入 30 U/mL rIL-2。


4. 按照特定的实验要求，在 37°C 下用加湿的 CO₂ 培养箱孵育细胞。


5. 每日检查培养物，注意细胞大小和形状。在耗竭的细胞培养物中，通常会观察到细胞缩小和增殖速率下降。


6. 充分重悬后，每周进行至少两次细胞计数。


7. 当细胞密度超过 2.5 x 10⁶ 个细胞/mL 或培养基变黄时，将培养物分开，使细胞在含有 30 U/mL rIL-2 的培养基中的密度回到 0.5-1 x 10⁶ 个细胞/mL。

重新刺激

出现耗竭迹象的细胞培养物（通常在扩增的第 7-10 天）可通过加入新鲜的 Dynabeads™ 人 T 活化剂 CD3/CD28 和 rIL-2 来重新刺激几次。反复重新刺激后，CD8+ T 细胞仍具有细胞毒性。在观察到细胞缩小及增殖速率下降时，通常需要重新刺激。有关重新刺激的指南见表2，不过我们建议您针对特定应用进行优化。请勿使用过量的 Dynabeads™ 人 T 活化剂 CD3/CD28，因为每个细胞对应的 Dynabeads™ 过量可能会抑制扩增。在重新刺激前，请将细胞转移至合适的试管中，借此去除用过的 Dynabeads™。将试管放在磁铁上 1-2 分钟，直至 Dynabeads™ 已移动到试管的侧面。将含有细胞的上清液转移到新试管中。

按以下说明继续操作。

1. 进行细胞计数并在合适的培养板或组织培养瓶中用含有 30 U/mL rIL-2 的培养基将细胞重悬至 1 x 10⁶ 个/mL 的密度。


2. 按 1:1 的微珠与细胞比加入 Dynabeads™ 人 T 活化剂 CD3/CD28。


3. 加入 30 U/mL rIL-2。


4. 按照特定实验要求的时长，在 37°C 下用加湿的 CO₂ 培养箱孵育细胞。


5. 每日检查培养物，注意细胞大小和形状。在耗竭的细胞培养物中，通常会观察到细胞缩小和增殖速率下降。


6. 充分重悬后，每周进行至少两次细胞计数。


7. 当细胞密度超过 2.5 x 10⁶ 个细胞/mL 或培养基变黄时，将培养物分开，使细胞在培养基中的密度回到 0.5-1 x 10⁶ 个细胞/mL。

表1：在含 30 U/mL rIL-2 的培养基中微珠与细胞比 = 1:1 的推荐体积。

表2：  有关抗 CD3/CD28 扩增培养物的重新刺激指南
 

* 为特定细胞设定最佳时间。请注意，这只是一般指南

由 Invitrogen Dynal AS 生产。Invitrogen Dynal AS 符合质量体系标准 ISO 9001:2000 和 ISO 13485:2003。我们的网站提供最新版包装说明书/使用说明书。如需更多技术信息，请访问我们的联系页面。 

材料描述

Dynabeads 人 T 活化剂 CD3/CD28 是均匀的 4.5 μm 超顺磁性聚合物微珠，包被了抗人 T 细胞 CD3 和 CD28 细胞表面分子的单克隆抗体的优化混合物。CD3 抗体对人 CD3 的 ε 链具有特异性，该链被认为是 TCR 复合物的亚基。CD28 抗体对人 CD28 共刺激分子具有特异性，该分子是 CD80 (B7-1) 和 CD86 (B7-2) 的受体。两种抗体都是偶联相同微珠的小鼠抗人 IgG，模拟 APC 体内刺激。微珠大小和共价抗体偶联技术都是关键参数，可同时为培养的 T 细胞提供较佳的刺激信号，从而充分活化和扩增 T 细胞。

相关 Dynabeads 产品

我们为 T 细胞和 T 细胞亚群分离提供全面的 Dynabeads 产品。请访问泛小鼠 IgG - 去除或阳性分离不同物种的细胞页面。 

储存和稳定性

在 2-8°C 下储存已开封的小瓶并保持无菌状态。请勿冷冻本品。在储存期间和所有操作步骤中，始终让 Dynabeads 处于悬浮液中，因为干燥会导致性能降低。使用前，请充分重悬微珠。如在未开封的情况下储存于 2-8°C 下，在标签上注明的失效日期前，本产品可一直保持稳定。

警告&限制

本产品仅用于研究目的。除非另有说明，否则不得用于任何动物或人的治疗或诊断。请遵循适当的实验室指南。分析/合规证书可应要求提供。材料安全数据表 (MSDS) 可在 获得。

1. Volpe E et al.(2008) A critical function for transfoming growth factor-β, interleukin 23 and proinflammatory cytokines in driving and modulating human Th-17 responses.Nat. Immunol.9(6):650-657.


2. De Fanis U et al.(2007) GATA3 upregulation associated with surface expression of CD294/CRTH2 : a unique feature of human Th cells.Blood 109(10):4343-4350.


3. Schade AE et al.(2008) Dasatinib, a small-molecule protein tyrosine kinase inhibitor, inhibits T-cell activation and proliferation.Blood 111(3):1366-1377.


4. Trickett A et al.(2003) T cell stimulation and expansion using anti-CD3/CD28 beads.J Imm Methods 275:251-255.


5. Ward FJ et al.(2008) Clonal regulatory T cells specific for a red blood cell autoantigen in human autoimmune hemolytic anemia.Blood 111(2):680-687.