从外周血单核细胞 (PBMC) 中分离未接触的人 CD8+ T 细胞

本方案旨在通过去除 B 细胞、NK 细胞、单核细胞、树突状细胞、CD4⁺ T 细胞、粒细胞，从外周血单核细胞 (PBMC) 中分离未接触的人 CD8⁺ T 细胞。分离的 CD8⁺ T 细胞无微珠和抗体，适用于任何下游应用。

分离原理

向起始样本中加入抗非 CD8⁺ T 细胞的生物素化单克隆抗体混合物并让其与细胞结合。加入 Depletion MyOne™ SA Dynabeads，它们将在短暂的孵育过程中结合抗体标记细胞。随后，在磁铁上分离微珠结合细胞并丢弃。剩余的未接触人 CD8⁺ T 细胞可用于任何应用。


下游应用

分离的 CD8⁺ T 细胞可用于任何应用，例如：

• 有关 CD8⁺ T 细胞增殖、凋亡和无反应性诱导的研究。
• 有关抗原特异性 T 细胞的研究。
• 有关调控 CD8⁺ T 细胞因子表达的研究。
• 流式细胞分析/FACS 分选。

所需的其他材料

• 兼具倾斜和旋转功能的混合器。
• 磁铁：请参阅 Dynabeads mRNA 纯化试剂盒（从总 RNA 制备液中纯化 mRNA）。
• 分离缓冲液：添加了 0.1% BSA 和 2mM EDTA 且不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（例如 Gibco 货号10010-023）。
• 热灭活胎牛血清 (FBS)/胎牛血清 (FCS)。
• 用于制备 PBMC 的 Lymphoprep（Axis Shield PoC，挪威）。

备注：

• BSA 可用人血清白蛋白 (HSA) 或 2% FBS/FCS 代替。
• EDTA 可用 0.6% 柠檬酸钠代替。
• 不建议使用含 Ca2+ 或 Mg2+ 的 PBS。

重要提示

• 使用前，应先洗涤 Dynabeads（请参阅 Dynabeads 洗涤程序）。
• 使用可以倾斜和旋转试管的混合器，确保 Dynabeads 不会沉淀在试管中。
• 务必按推荐次数用力吹打，以防 NK 细胞滞留在微珠结合细胞部分（第3章，第9步和第14步）。移液时，尽量避免出现气泡。
• 请遵循推荐的体积和孵育时间。（切勿使用少于推荐体积的 Dynabeads）。
• 让缓冲液保持低温！

Dynabeads 洗涤程序

使用前，应先洗涤 Dynabeads。

1. 在小瓶中重悬 Dynabeads。（即旋晃 >30 秒或倾斜并旋转5分钟。）


2. 将所需体积的 Dynabeads 转移至试管中。


3. 加入相同体积或至少 1 mL 的分离缓冲液并混合。


4. 将试管放入磁铁1分钟并丢弃上清液。


5. 从磁铁中取出试管，在体积与 Dynabeads 初始体积（第2步）相同的分离缓冲液中重悬洗过的 Dynabeads

制备 PBMC

• 按照推荐的样本制备方案（血小板数量低）制备 PBMC 悬浮液。 有关推荐的样本制备程序，请访问泛小鼠 IgG - 去除或阳性分离不同物种的细胞并点击我们的快速链接。  
• 在分离缓冲液中以 1 x 10⁸ 个 PBMC/mL 的浓度重悬悬浮液。

分离程序

本方案基于 1 × 10⁷ 个 PBMC，可以根据表1从 1 × 10⁷ 扩展到 5 × 10⁸ 个细胞。

表1. 适用于人 CD8⁺ T 细胞分离的体积

* 请注意，小规模与大规模方案的体积有所不同是为了在有微珠的情况下进行孵育时达到良好的工作体积。可以在处理的任何细胞水平上从小规模切换成大规模参数，只要得到的体积在有微珠的情况下进行孵育时适合所用试管就行（超过总试管体积的 1/10）。

• 此方案的起始细胞数量为 5 x 10⁷（有关详情，请参阅上文的制备） 

1. 将分离缓冲液中的 500 μL (5 × 10⁷) PBMC 转移至试管中。


2. 加入 100 μL 热灭活 FCS。


3. 加入 100 μL 抗体混合物。


4. 混合均匀并在 2-8°C 下孵育20分钟。


5. 加入 10 mL 分离缓冲液来洗涤细胞。倾斜试管几次以混合均匀，并在 2-8°C 下以 350 × g 的速度离心8分钟。丢弃上清液。


6. 在 500 μL 分离缓冲液中重悬细胞。


7. 加入 500 μL 经过预洗涤的 Depletion MyOne SA Dynabeads。


8. 在 18-25°C 下孵育15分钟，同时轻轻倾斜和旋转试管。


9. 使用窄口移液器（如 1000 μL 移液器吸头或 5 mL 血清移液器）用力吹打 >10 次来重悬微珠结合细胞。


10. 加入 5 mL 分离缓冲液。（在有微珠的情况下进行孵育时，如果工作体积 < 1 mL，则在重悬前加入 1 mL 分离缓冲液）。


11. 将试管放入磁铁2分钟。


12. 将含有未接触人 NK 细胞的上清液转移到新试管中。


13. 向装有 Dynabeads 的试管中加入 5 mL 分离缓冲液。


14. 通过用力吹打（如第9步所述）重悬微珠结合细胞。


15. 将试管放入磁铁2分钟


16. 合并两份上清液。


17. 可选：如需去除残留的微珠，将试管放入磁铁2分钟，然后将细胞转移至新试管中。

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