阳性磁性分离或去除人类样本中的 CD25 T 细胞

本方案适用于阳性磁性分离或去除人类样本（如单核细胞 (MNC) 或全血）中的 CD25^高 T 细胞。Dynabeads® 在短暂的孵育过程中结合靶细胞，然后用磁铁分离微珠结合细胞。

去除 – 丢弃微珠结合细胞并将剩余的未接触细胞用于任何应用。

阳性分离 – 丢弃上清液并将微珠结合细胞用于下游分子应用。

本方案描述了从多达 2.5x10⁷ 个 MNC 中分离细胞的步骤。分离的细胞非常适用于下游分子检测，如蛋白和基因表达分析。

下游应用

分离的细胞可以在附着到微珠时进行裂解，并直接处理以用于进一步分子分析。有关推荐产品和方案，请访问免疫学研究指南页面。 

其他要求

• 分离缓冲液：添加了 0.1% BSA 和 2mM EDTA 且不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS)，例如 Gibco 货号14190-094。
• 兼具倾斜和旋转功能的混合器。
• 磁铁 (Dynal® MPC™)：有关磁铁建议，请参阅 Dynabeads® mRNA 纯化试剂盒（从总 RNA 制备液中纯化 mRNA）页面。

重要提示

• 使用可以倾斜和旋转试管的混合器，确保 Dynabeads® 不会沉淀在管底。
• 切勿使用少于推荐体积的 Dynabeads®。
• 请小心遵循推荐的移液体积和孵育时间。
• 移液时，避免出现气泡。
  

每 mL 人血约含有 1x10⁶ 个 T 细胞，其中约有 5-10% 的 T 细胞会强烈表达 CD25 抗原。本方案描述了使用 Dynabeads® CD25 从 2.5x10⁷ 个人单核细胞 (MNC) 中去除或阳性分离 CD25^高 T 细胞的步骤。

如要增加细胞数量，请相应调整体积。

制备

• 从全血开始或按标准程序分离 抗凝 外周血或富含白细胞的血沉棕黄层中的 MNC（有关更多信息，请参阅技术支持）。
• 每 2.5x10⁷ 个细胞制备约 6 mL 分离缓冲液。

Dynabeads® 洗涤程序
使用前，应先洗涤 Dynabeads®。

• 在小瓶中重悬 Dynabeads®。
• 将所需体积的 Dynabeads® 转移至试管中。
• 加入相同体积或至少 1 mL 的分离缓冲液并混合。
• 将试管放入磁铁1分钟并丢弃上清液。
• 从磁铁中取出试管，在体积与 Dynabeads® 初始体积（要点2）相同的分离缓冲液中重悬洗过的 Dynabeads®。

去除或阳性分离 CD25⁺ 细胞

• 在 1 mL 分离缓冲液中重悬 2.5x10⁷ 个 MNC，然后加入 25 μL（阳性分离）或 50 μL（去除）洗过的 Dynabeads® CD25。
• 在 2-8°C 下孵育20分钟（阳性分离）或30分钟（去除），同时轻轻倾斜和旋转试管。
• 将试管放入磁铁2分钟。
• 如需去除，将上清液转移至新试管中，待进一步使用。
• 如需阳性分离，丢弃上清液并洗涤 微珠捕获 细胞3次（洗涤方法：在分离缓冲液中重悬至原样本体积），然后使用磁铁进行分离。
• 在 2-8°C 下保存细胞，直至进一步用于下游应用。 

为了快速得出一致的蛋白或基因表达分析结果，在 CD25⁺ 细胞仍附着到微珠时进行裂解，并直接处理以用于进一步分子分析。如需更多技术建议，请访问泛小鼠 IgG - 去除或阳性分离不同物种的细胞。  

Invitrogen Dynal® AS 符合质量体系标准 ISO 9001:2000 和 ISO 13485:2003。

储存/稳定性

如在未开封的情况下储存于 2-8°C 下，在标签上注明的失效日期前，本产品可一直保持稳定。请在 2-8°C 下储存已开封的小瓶并避免细菌污染。在储存期间和所有操作步骤中，始终让 Dynabeads® 处于悬浮液中，因为干燥会导致性能降低。使用前，请充分重悬。

警告和限制

本产品仅用于研究目的。除非另有说明，否则不得用于任何动物或人的治疗或诊断。请遵循适当的实验室指南。本产品含有 0.02% 叠氮化钠（作为防腐剂，具有细胞毒性）。

不要用嘴吹打！

叠氮化钠可与铅和铜管发生反应，形成极易爆炸的金属叠氮化物。通过管道排放进行处置时，请用大量水冲洗，以防止叠氮化物积聚。分析证书 (CoA) 可应要求提供。材料安全数据表 (MSDS) 可在 获得。

技术支持

分离缓冲液

添加了 0.1% BSA 和 2mM EDTA 的 PBS（磷酸盐缓冲盐水），例如 Gibco 货号14190-094。
如果您愿意，可以使用含 2% 胎牛血清和 1 mM EDTA 的 PBS。

从血沉棕黄层制备 MNC

这种方法得到的血小板数量较低，因此建议与 Dynabeads® 产品配合使用。

1. 在 18-25°C 下，使用含 0.1% BSA + 0.6% 柠檬酸钠或 2 mM EDTA 的 PBS 将 10-18 mL 血沉棕黄层稀释至总体积为 35 mL。


2. 在 15 mL Lymphoprep™ 上添加稀释后的血沉棕黄层。


3. 在 20°C 下，以 160 x g 的速度离心20分钟。在不使用制动器的情况下让其减速。


4. 移除 20 mL 上清液以去除血小板。


5. 在 20°C 下，以 350 x g 的速度离心20分钟。在不使用制动器的情况下让其减速。


6. 从血浆/Lymphoprep 分界面回收 MNC 并将细胞转移至 50 mL 试管中。


7. 在 2-8°C 下，使用含 0.1% BSA 的 PBS 通过以 400 x g 的速度离心8分钟的方式洗涤 MNC 一次。


8. 在 2-8°C 下，使用含 0.1% BSA 的 PBS 通过以 225 x g 的速度离心8分钟的方式洗涤 MNC 两次，然后以 2.5 x 10⁷ 个 MNC/mL 的浓度在分离缓冲液中重悬 MNC。

如果起始样本并非血沉棕黄层，请参阅泛小鼠 IgG - 去除或阳性分离不同物种的细胞页面，了解推荐的 MNC 制备程序。 如需更多技术信息，请联系 Invitrogen Dynal®（请参阅详细联系信息）。