分离或去除人 CD4+ T 细胞 - 全血、血沉棕黄层、MNC

使用 Dynabeads CD4 直接分离或去除全血、血沉棕黄层或 MNC 中的人 CD4⁺ T 细胞。为了快速得出一致的蛋白或基因表达分析结果，在 CD4⁺ T 细胞仍附着到微珠时进行裂解，并直接处理以用于进一步分子分析。对于基于细胞的下游应用（需要无微珠 CD4⁺ 细胞），Invitrogen Dynal 建议使用 Dynabeads FlowComp™ 人 CD4 试剂盒（货号 113.61D）。

分离原理

Dynabeads 与试管中的细胞样本混合。Dynabeads 将在短暂的孵育过程中结合靶细胞，然后用磁铁分离微珠结合细胞。

• 阳性分离 – 丢弃上清液并将微珠结合细胞用于下游分子应用。
• 去除 – 丢弃 微珠结合 细胞并将剩余的未接触细胞用于任何应用。

材料描述

Dynabeads CD4 是均匀的超顺磁性聚苯乙烯微珠（直径 4.5 μm），包被了对人细胞上的 CD4 膜抗原具有特异性的单克隆一抗。CD4 一抗通过人 IgG4 抗小鼠 IgG 二抗与 Dynabeads 偶联。人单克隆抗体的来源不含人免疫缺陷病毒 (HIV)、乙肝病毒 (HBV) 以及丙肝病毒 (HCV)。

提供的材料

• 5 mL Dynabeads CD4。  以 pH 7.4、含 0.1% 牛血清白蛋白 (BSA) 和 0.02% 叠氮化钠 (NaN₃) 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 的形式提供，浓度为 4 x 10⁸ 个微珠/mL。
• 本产品将处理多达 2 x 10⁹ 个细胞。

所需的其他材料

• 磁铁 (Dynal MPC™)：有关磁铁建议，请参阅 Dynabeads mRNA 纯化试剂盒（从总 RNA 制备液中纯化 mRNA）。
• 兼具倾斜和旋转功能的混合器。
• 缓冲液1：含 0.1% BSA 和 2 mM EDTA 的 PBS，pH 7.4。

重要提示：

• BSA 可用人血清白蛋白 (HSA) 或胎牛血清 (FCS) 代替。
• EDTA 可用柠檬酸钠代替。
• 不建议使用含 Ca²⁺ 或 Mg²⁺ 的 PBS。

Dynabeads 洗涤程序

使用前，应先洗涤 Dynabeads。

1. 在小瓶中重悬 Dynabeads。


2. 将所需体积的 Dynabeads 转移至试管中。


3. 加入相同体积或至少 1 mL 的缓冲液1并混合。


4. 将试管放入磁铁1分钟并丢弃上清液。


5. 从磁铁中取出试管，在体积与 Dynabeads 初始体积（第2步）相同的缓冲液1中重悬洗过的 Dynabeads。

样本制备

可直接分离任何样本（如全血、骨髓、MNC 或组织消化物）中的细胞。

有关推荐的样本制备程序，请访问泛小鼠 IgG - 去除或阳性分离不同物种的细胞并点击我们的快速链接。 

全血和血沉棕黄层

大多数去除和阳性分离都可使用全血和血沉棕黄层作为起始样本。血沉棕黄层的浓度是全血的 8-10 倍（就白细胞数量而言）。对于本产品，您必须
洗涤血液/血沉棕黄层以去除造成干扰的可溶性因子。

1. 在缓冲液1中稀释全血或血沉棕黄层 (1+2)。


2. 在 2-8°C 下以 600 x g 的速度离心10分钟。


3. 丢弃血浆部分/上层。在缓冲液1中，分别将血液和血沉棕黄层重悬至原始体积和原始体积的两倍，然后再加入微珠。

细胞分离的关键步骤

• 使用可以倾斜和旋转试管的混合器，确保 Dynabeads 不会沉淀在管底。
• 孵育 Dynabeads 和细胞时，孵育温度必须介于 2-8°C 之间，以减少吞噬活性和其他代谢过程。
• 对于每 mL 细胞样本，切勿使用少于 25 μL (1 x 10⁷) Dynabeads，每个靶细胞应至少对应4个 Dynabeads。

表1：每 10⁷ 个细胞添加的 Dynabeads 体积。可以根据需要增加体积。

去除或阳性分离 CD4⁺ T 细胞

1. 根据表1将适当体积的 Dynabeads 加入制备的样本中。


2. 在 2-8°C 下孵育20分钟（阳性分离）或30分钟（去除），同时轻轻倾斜和旋转试管。


3. 将试管放入磁铁2分钟。


4. 如需去除，将上清液转移至新试管中，待进一步使用。


5. 如需阳性分离，丢弃上清液并洗涤微珠结合细胞3次（洗涤方法：在缓冲液1中重悬至原样本体积），然后使用磁铁分离1分钟。在各洗涤步骤中，切勿使用少于 1 mL 缓冲液1。对于分子研究，在细胞仍附着到微珠时进行裂解，并将上清液转移至新试管中以进行蛋白或基因表达分析。

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