介绍

本产品旨在通过去除 B 细胞、NK 细胞、单核细胞、血小板、树突状细胞、CD8+ T 细胞、粒细胞和红细胞，从外周血单核细胞 (PBMC) 中分离未接触的人 CD4+ T 细胞。分离的 CD4+ T 细胞无微珠和抗体，适用于任何下游应用。

分离原理

向起始样本中加入抗非 CD4+ T 细胞的小鼠 IgG 抗体混合物并让其与细胞结合。加入 Depletion MyOne™ Dynabeads，它们将在短暂的孵育过程中结合抗体标记细胞。随后，在磁铁上分离微珠结合细胞并丢弃。剩余的未接触人 CD4+ T 细胞可用于任何应用


下游应用

分离的 CD4+ T 细胞可用于任何应用，例如：

  • 有关 CD4+ T 细胞增殖、凋亡和无反应性诱导的研究
  • 有关抗原特异性 T 细胞的研究
  • 有关调控 CD4+ T 细胞因子表达的研究
  • 流式细胞分析/FACS 分选



样本制备

从 PBMC 悬浮液中分离未接触的 CD4+ T 细胞。我们建议使用会得到较少血小板的样本制备程序。 有关推荐的样本制备程序，请参阅技术建议或访问泛小鼠 IgG - 去除或阳性分离不同物种的细胞。  

所需的其他材料

  • 兼具倾斜和旋转功能的混合器。
  • 磁铁：我们建议使用 DynaMag™-15（货号123.01D，适用于 1-15 mL 样本）和 DynaMag™-50（货号123.02D，适用于 5-50 mL 样本）。也可使用 Dynal MPC™ 磁铁，但 Dynal MPC-1（货号120.01D）除外。
  • 分离缓冲液：添加了 0.1% BSA 和 2mM EDTA 且不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（例如 Gibco 货号10010-023）。
  • 热灭活胎牛血清 (FBS)/胎牛血清 (FCS)。
  • 用于制备 PBMC 的 Lymphoprep（Axis Shield PoC，挪威）。


备注：

  • BSA 可用人血清白蛋白 (HSA) 或 2% FBS/FCS 代替。
  • EDTA 可用 0.6% 柠檬酸钠代替。
  • 不建议使用含 Ca2+ 或 Mg2+ 的 PBS。


重要提示

  • 使用前，应先洗涤 Dynabeads（请参阅 Dynabeads 洗涤程序）。
  • 使用可以倾斜和旋转试管的混合器，确保 Dynabeads 不会沉淀在试管中
  • 本产品不可与 Dynal MPC™-1（货号120.01D）配合使用。请参阅技术建议。
  • 请遵循推荐的体积和孵育时间。
  • 移液时，避免出现气泡。
  • 让缓冲液保持低温！

方案

Dynabeads 洗涤程序

  1. 在小瓶中重悬 Dynabeads。

  2. 将所需体积的 Dynabeads 转移至试管中。

  3. 加入相同体积或至少 1 mL 的分离缓冲液并混合。

  4. 将试管放入磁铁1分钟并丢弃上清液。

  5. 从磁铁中取出试管，在体积与 Dynabeads 初始体积（第2步）相同的分离缓冲液中重悬洗过的 Dynabeads。

制备

按照推荐的样本制备方案（血小板数量低，请参阅技术建议）制备 PBMC 悬浮液。 在分离缓冲液中以 1 x 10 8 个 PBMC/mL 的浓度重悬悬浮液。

分离程序

本方案基于 1 × 10 7 个 PBMC，可以根据表1从 1 × 10 7 扩展到 5 × 10 8 个细胞。表1.适用于人 CD4 + T 细胞分离的体积（可从 1 × 10 7 扩展到 5 × 10 8 个 PBMC）。如果细胞数量低于 1 × 10 7，请使用如下所示的体积。如果细胞数量高于 1 × 10 7，请相应增加体积。


每 1 x 107 个 PBMC 的工作体积 每 5 x 108 个 PBMC 的工作体积
细胞体积（第1步）
100 μL
5 mL
FBS/FCS（第2步）
20 μL
1 mL
抗体混合物（第3步）
20 μL
1 mL
洗涤（第5步）
2 mL
最多 40 mL
重悬（第6步）
100 μL
5 mL
Depletion MyOne Dynabeads（第7步）
100 μL
5 mL
磁性分离前
加入的体积（第10步）*
1 mL
最多 35 mL

* 请注意，小规模与大规模方案的体积有所不同是为了在有微珠的情况下进行孵育时达到良好的工作体积。可以在处理的任何细胞水平上从小规模切换成大规模参数，只要得到的体积在有微珠的情况下进行孵育时适合所用试管就行（超过总试管体积的 1/5）。

  1. 将分离缓冲液中的 100 μL (1 × 107) PBMC 转移至试管中。

  2. 加入 20 μL 热灭活 FCS。

  3. 加入 20 μL 抗体混合物。

  4. 混合均匀并在 2-8°C 下孵育20分钟。

  5. 加入 2 mL 分离缓冲液来洗涤细胞。倾斜试管几次以混合均匀，并在 2-8°C 下以 300 × g 的速度离心8分钟。丢弃上清液。

  6. 在 100 μL 分离缓冲液中重悬细胞。

  7. 加入 100 μL 经过预洗涤的 Depletion MyOne Dynabeads。

  8. 在 18-25°C 下孵育15分钟，同时轻轻倾斜和旋转试管。

  9. 使用窄口移液器（如 1000 μL 移液器吸头或 5 mL 血清移液器）用力吹打 >10 次来重悬微珠结合细胞。

  10. 加入 1 mL 分离缓冲液。

  11. 将试管放入磁铁2分钟。

  12. 将上清液转移到新试管中。

  13. 使用装有 Dynabeads 的试管重复第 10-12 步，然后合并两份上清液。

上清液含有阴性分离的人 CD4 + T 细胞

技术建议

样本制备

从血沉棕黄层制备 PBMC 以获得较低数量的血小板：

  1. 在 18-25°C（室温）下，使用 PBS 分离缓冲液将 10-15 mL 血沉棕黄层稀释至总体积为 35 mL。

  2. 在 15 mL Lymphoprep 上添加稀释后的血沉棕黄层。

  3. 在室温下以 160 x g 的速度离心20分钟。在不使用制动器的情况下让其减速。

  4. 移除 18-20 mL 上清液以去除血小板。

  5. 在室温下以 350 x g 的速度离心20分钟。在不使用制动器的情况下让其减速。

  6. 从血浆/Lymphoprep 分界面回收 PBMC 并将细胞转移至 50 mL 试管中。

  7. 在 2-8°C 下，使用分离缓冲液通过以 400 x g 的速度离心8分钟的方式洗涤 PBMC 一次。

  8. 在 2-8°C 下，使用分离缓冲液通过以 225 x g 的速度离心8分钟的方式洗涤 PBMC 两次，然后以 1 x 108 个 PBMC/mL 的浓度在分离缓冲液中重悬 PBMC。

基本信息

Invitrogen Dynal AS 符合质量体系标准 ISO 9001:2000 和 ISO 13485:2003。

材料描述

Depletion MyOne™ Dynabeads (20 mg/mL) 是均匀的超顺磁性聚合物微珠（直径 1.0 μm），以 pH 7.4、含 0.1% 牛血清白蛋白 (BSA) 和 0.02% 叠氮化钠 (NaN 3) 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 的形式提供。Dynabeads 包被了单克隆人 IgG4 抗小鼠 IgG 抗体，此抗体可识别所有小鼠 IgG 亚类且具有 Fc 特异性。人单克隆抗体的来源不含人免疫缺陷病毒 (HIV)、乙肝病毒 (HBV) 以及丙肝病毒 (HCV)。抗体混合物含有抗 CD8、CD14、CD16（对 CD16a 和 CD16b 具有特异性）、CD19、CD36、CD56、CDw123 和 CD235a（血型糖蛋白 A）的小鼠 IgG 抗体。以含有 0.5% BSA 和 0.02% 叠氮化钠 (NaN 3) 的 PBS 的形式提供。

储存/稳定性

如在未开封的情况下储存于 2-8°C 下，在标签上注明的失效日期前，本产品可一直保持稳定。请在 2-8°C 下储存已开封的小瓶并避免细菌污染。在储存期间和所有操作步骤中，始终让 Dynabeads 处于悬浮液中，因为干燥会导致性能降低。使用前，请充分重悬。

警告和限制

本产品仅用于研究目的。除非另有说明，否则不得用于任何动物或人的治疗或诊断。请遵循适当的实验室指南。本产品含有 0.02% 叠氮化钠（作为防腐剂，具有细胞毒性）。

不要用嘴吹打！

叠氮化钠可与铅和铜管发生反应，形成极易爆炸的金属叠氮化物。通过管道排放进行处置时，请用大量水冲洗，以防止叠氮化物积聚。分析证书 (CoA) 可应要求提供。材料安全数据表 (MSDS) 可在 获得。

参考文献

  1. Aasheim HC et al (2005) Ephrin-A1 binding to CD4+ T lymphocytes stimulates migration and induces tyrosine phosphorylation of PYK2.Blood 105: 2869-2876.

  2. Jarnak-Jankovic S et all (2005) Evaluation of dendritic cells loaded with apoptotic cancer cells or expressing

  3. tumour mRNA as potential cancer vaccines against leukemia.BMC Cancer.5:20 doi:10.1186/1471-2407-5-20.

  4. Zhang R et al (2004) CD40 ligand dysregulation in HIV infection: HIV glycoprotein 120 inhibits signalling cascades upstream of CD40 ligand transcription.J. Immunol.172:2678-2686.

  5. Hamez-Cognasse et al (2008).Direct contact of platelets and their released products exert different effects on human dendritic cell maturation.BMC Immunology 9:54 doi:10.1186/1471-2172-9-5.

  6. Ghannam et al (2008).Human CD3 Deficiency Associated with Impairments in Dendritic Cell Differentiation, Memory B Cells, and Regulatory T Cells.The Journal of Immunology 184: 5158-5166.

113.46D_52D.indd    版本003     2009年5月5日

仅供科研使用，不可用于诊断目的。