介绍

本方案旨在通过去除非 NK 细胞（T 细胞、B 细胞、单核细胞、树突状细胞、血小板、巨噬细胞、粒细胞和红细胞），从外周血单核细胞 (PBMC) 中分离未接触的人 NK 细胞。分离的 NK 细胞无微珠和抗体，适用于任何下游应用。

分离原理

向起始样本中加入 FCS 和抗非 NK 细胞的生物素化单克隆抗体混合物（抗体混合物）。加入 Depletion MyOne SA Dynabeads，让其在短暂的孵育过程中结合非 NK 细胞。用磁铁分离微珠结合细胞。丢弃微珠结合细胞并将剩余的未接触 NK 细胞用于任何应用。


下游应用

分离的 NK 细胞可用于任何应用，例如：测量细胞因子的产生（免疫反应）、癌症研究、功能性试验、分子研究和流式细胞分析。（有关推荐产品和方案，请访问免疫学研究指南。） 研究证明，阴性分离的 NK 细胞保留了对 K562 细胞的细胞毒活性 (1,3,4)。


所需的其他材料

  • 兼具倾斜和旋转功能的混合器。
  • 磁铁：请参阅 Dynabeads mRNA 纯化试剂盒（从总 RNA 制备液中纯化 mRNA）。
  • 分离缓冲液：添加了 0.1% BSA 和 2mM EDTA 且不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（例如 Gibco 货号10010-023）。
  • 热灭活胎牛血清 (FBS)/胎牛血清 (FCS)。
  • 用于制备 PBMC 的 Lymphoprep®（Axis Shield PoC，挪威）。
  • 让缓冲液保持低温！


备注：

  • BSA 可用人血清白蛋白 (HSA) 或 2% FBS/FCS 代替。
  • EDTA 可用 0.6% 柠檬酸钠代替。
  • 不建议使用含 Ca2+ 或 Mg2+ 的 PBS。


重要提示

  • 使用前，应先洗涤 Dynabeads（请参阅 Dynabeads 洗涤程序）。
  • 使用可以倾斜和旋转试管的混合器，确保 Dynabeads 不会沉淀在试管中。
  • 务必按推荐次数用力吹打，以防 CD8 T 细胞滞留在微珠结合细胞部分。移液时，尽量避免出现气泡。
  • 本产品不可与 Dynal MPC-1（货号120.01D）配合使用。
  • 请遵循推荐的体积和孵育时间。

方案

Dynabeads 洗涤程序

使用前，应先洗涤 Dynabeads。

  1. 在小瓶中重悬 Dynabeads。（即旋晃 >30 秒或倾斜并旋转5分钟。）

  2. 将所需体积的 Dynabeads 转移至试管中。

  3. 加入相同体积或至少 1 mL 的分离缓冲液并混合。

  4. 将试管放入磁铁1分钟并丢弃上清液。

  5. 从磁铁中取出试管，在体积与 Dynabeads 初始体积（第2步）相同的分离缓冲液中重悬洗过的 Dynabeads®


制备 PBMC

  • 按照推荐的样本制备方案（血小板数量低）制备 PBMC 悬浮液。 有关推荐的样本制备程序，请访问泛小鼠 IgG - 去除或阳性分离不同物种的细胞并点击我们的快速链接。 
  • 在分离缓冲液中以 1 x 108 个 PBMC/mL 的浓度重悬悬浮液。


分离程序

本方案基于 1 × 107 个 PBMC，可以根据表1从 1 × 107 扩展到 5 × 108 个细胞。

表1. 适用于人 NK 细胞分离的体积 

 每 5 x 107 个 PBMC 的工作体积每 5 x 108 个 PBMC 的工作体积
试管尺寸15 mL50 mL
细胞体积（第1步）500 μL5 mL
FBS/FCS（第2步）100 μL1 mL
抗体混合物（第3步）100 μL1 mL
洗涤（第5步）10 mL40 mL
重悬（第6步）500 μL5 mL
Depletion MyOne Dynabeads®（第7步）500 μL5 mL
磁性分离前
加入的体积（第10步）*		5 mL20 mL


* 请注意，小规模与大规模方案的体积有所不同是为了在有微珠的情况下进行孵育时达到良好的工作体积。可以在处理的任何细胞水平上从小规模切换成大规模参数，只要得到的体积在有微珠的情况下进行孵育时适合所用试管就行（超过总试管体积的 1/10）。

  • 此方案的起始细胞数量为 5 x 107（有关详情，请参阅上文的制备） 
  1. 将分离缓冲液中的 500 μL (5 × 107) PBMC 转移至试管中。

  2. 加入 100 μL 热灭活 FCS。

  3. 加入 100 μL 抗体混合物。

  4. 混合均匀并在 2-8°C 下孵育20分钟。

  5. 加入 10 mL 分离缓冲液来洗涤细胞。倾斜试管几次以混合均匀，并在 2-8°C 下以 300 × g 的速度离心8分钟。丢弃上清液。

  6. 在 500 μL 分离缓冲液中重悬细胞。

  7. 加入 500 μL 经过预洗涤的 Depletion MyOne SA Dynabeads。

  8. 在 18-25°C 下孵育15分钟，同时轻轻倾斜和旋转试管。

  9. 使用窄口移液器（如 1000 μL 移液器吸头或 5 mL 血清移液器）用力吹打 >10 次来重悬微珠结合细胞。

  10. 加入 5 mL 分离缓冲液。（在有微珠的情况下进行孵育时，如果工作体积 < 1 mL，则在重悬前加入 1 mL 分离缓冲液）。

  11. 将试管放入磁铁2分钟。

  12. 将含有未接触人 CD8+ T 细胞的上清液转移到新试管中。

  13. 向装有 Dynabeads 的试管中加入 5 mL 分离缓冲液。

  14. 通过用力吹打（如第9步所述）重悬微珠结合细胞。

  15. 将试管放入磁铁2分钟

  16. 合并两份上清液。

  17. 可选：如需去除残留的微珠，将试管放入磁铁2分钟，然后将细胞转移至新试管中。

 

技术建议

样本制备

从血沉棕黄层制备 PBMC 以获得较低数量的血小板：

  1. 在 18-25°C（室温）下，使用 PBS 分离缓冲液将 10-15 mL 血沉棕黄层稀释至总体积为 35 mL。

  2. 在 15 mL Lymphoprep® 上添加稀释后的血沉棕黄层。

  3. 在室温下以 160 x g 的速度离心20分钟。在不使用制动器的情况下让其减速。

  4. 移除 18-20 mL 上清液以去除血小板。

  5. 在室温下以 350 x g 的速度离心20分钟。在不使用制动器的情况下让其减速。

  6. 从血浆/Lymphoprep® 分界面回收 PBMC 并将细胞转移至 50 mL 试管中。

  7. 在 2-8°C 下，使用分离缓冲液通过以 400 x g 的速度离心8分钟的方式洗涤 PBMC 一次。

  8. 在 2-8°C 下，使用分离缓冲液通过以 225 x g 的速度离心8分钟的方式洗涤 PBMC 两次，然后以 1 x 108 个 PBMC/mL 的浓度在分离缓冲液中重悬 PBMC。

基本信息

Thermo Fisher Scientific AS 符合质量体系标准 ISO 9001:2008 和 ISO 13485:2003。

材料描述

Depletion MyOne SA Dynabeads 包被了链霉亲和素，以 pH 7.4、含 0.1% 牛血清白蛋白 (BSA) 和 0.02% 叠氮化钠（作为防腐剂）的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 的形式提供，浓度为 10 mg 微珠/mL。抗体混合物含有生物素化单克隆抗体，以含有 0.5% BSA 和 0.02% 叠氮化钠的 PBS 的形式提供。抗体是用于 CD3、CD14、CD36、CDw123、HLA II 类 DR/DP 和 CD235a（血型糖蛋白 A）的生物素化小鼠抗人 IgG 抗体。

储存/稳定性

如在未开封的情况下储存于 2-8°C 下，在标签上注明的失效日期前，本产品可一直保持稳定。请在 2-8°C 下储存已开封的小瓶并避免细菌污染。在储存期间和所有操作步骤中，始终让 Dynabeads 处于悬浮液中，因为干燥会导致性能降低。使用前，请充分重悬。

警告和限制

本产品仅用于研究目的。除非另有说明，否则不得用于任何动物或人的治疗或诊断。请遵循适当的实验室指南。本产品含有 0.02% 叠氮化钠（作为防腐剂，具有细胞毒性）。

不要用嘴吹打！

叠氮化钠可与铅和铜管发生反应，形成极易爆炸的金属叠氮化物。通过管道排放进行处置时，请用大量水冲洗，以防止叠氮化物积聚。分析证书 (CoA) 可应要求提供。材料安全数据表 (MSDS) 可在 获得。

参考文献

  1. Andersen MH et al (2005) Spontaneous Immunity against Bcl-xL in Cancer Patients.J. Immunol.175: 2709-2714.

  2. Chemnitz JM et al (2004) SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation but only receptor ligation prevents T cell activation.J. Immunol.173: 945-954.

  3. Jarnak-Jankovic S et al (2005) Evaluation of dendritic cells loaded with apoptotic cancer cells or expressing tumour mRNA as potential cancer vaccines against leukemia.BMC Cancer.5:20 doi:10.1186/1471-2407-5-20.

  4. Monteiro M et al (2007) Cartography of gene expression in CD8 single cells: novel CCR7- subsets suggest differentiation independent of CD45RA expression.Blood.109:2863-2870.

  5. van Rhee F et al (2005) NY-ESO-1 is highly expressed in poor prognosis multiple myeloma and induces spontaneous humoral and cellular immune responses.Blood.(Pre-published online): 10.1182/blood-2004-09-3707.

  6. Zioza A et al (2003) CD8+ T cells that express CD4 on their surface (CD4dim-CD8bright T cells) recognize an antigenspecific target, are detected in vivo and can be productively infected by T-tropic HIV.Blood 102: 2156-2164.

 

113.49D.indd    版本001     2008年5月5日

仅供科研使用，不可用于诊断目的。