分离或去除全血、血沉棕黄层、骨髓、MNC、组织样本中的人上皮细胞

使用 Dynabeads Epithelial Enrich 直接分离或去除全血、血沉棕黄层、骨髓、MNC 或组织样本中的人上皮细胞 (1, 2)。富集的细胞是存活细胞，可用于细胞应用，也可进行裂解以用于进一步分子分析，如 mRNA 分离和 RT-PCR。(3,4,5,6,7,8)

对于流式细胞分析，我们建议使用 Dynabeads CELLection™ Epithelial Enrich（货号 162.03）。

循环肿瘤上皮细胞极为罕见，在 10⁶ 个 MNC 中，可能仅有 1-10 个，为了对肿瘤细胞实现充分的特异性和灵敏度，富集步骤通常必不可少 (5,6,9,10,11)。

分离原理

Dynabeads 与试管中的样本混合。Dynabeads 将在短暂的孵育过程中结合靶细胞，随后可以用磁铁分离微珠结合细胞。然后将 Dynabeads 与试管中的细胞样本混合。

• 阳性分离 – 丢弃上清液并将微珠结合细胞用于下游应用（如细胞培养、蛋白或基因表达分析）。对于进一步分子应用，可以在上皮细胞仍附着到微珠时进行裂解。
• 去除 – 丢弃微珠结合细胞并将剩余的未接触细胞用于任何应用。

材料描述

Dynabeads Epithelial Enrich 是均匀的超顺磁性聚苯乙烯微珠（直径 4.5 μm），包被了对大多数人类正常和肿瘤上皮组织上表达的两种（34 和 39 kDa）糖聚肽膜抗原具有特异性的小鼠 IgG1 单克隆抗体（克隆 Ber-EP4）(12)。该抗体的反应性与 mAb 克隆 HEA125 相同。

提供的材料

5 mL Dynabeads Epithelial Enrich

以含有 0.1% 牛血清白蛋白 (BSA) 和 0.02% 叠氮化钠 (NaN³) 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 的形式提供，浓度为 4 x 10⁸ 个微珠/mL。

产品容量

* 样本数量不含对照品

所需的其他材料

• 磁铁（如 DynaMag™）以及可以倾斜和旋转试管的混合器。有关磁铁和混合器的建议

• 洗涤和分离缓冲液：含 0.1% BSA 和 0.6% 柠檬酸钠的 PBS（不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺），pH 7.4。

重要提示

• 在孵育和分离过程中，务必让细胞悬液和缓冲液保持低温 (2-8°C)，以防 Dynabeads 被吞噬。
• 必须轻轻处理微珠结合细胞。不要过度吹打。

• 不建议使用含 Ca²⁺ 或 Mg²⁺ 的 PBS。
• BSA 可用 HSA 或 FCS 代替。 柠檬酸钠可用 EDTA 代替。

• 请遵循磁铁建议，确保成功分离。

Dynabeads 洗涤程序

使用前，应先洗涤 Dynabeads。

  1.   在小瓶中重悬 Dynabeads。

  2.   将所需体积的 Dynabeads 转移至试管中。

  3.   加入相同体积或至少 1 mL 的缓冲液（含 0.1% BSA 和 0.6% 柠檬酸钠的 PBS）并混合。

  4.   将试管放入磁铁1分钟并丢弃上清液。

  5.   从磁铁中取出试管，使用体积与原始体积（第2步）相同的缓冲液重悬 Dynabeads。

样本制备

可直接分离任何样本（如全血、骨髓、MNC 或组织消化物）中的细胞。MNC（例如来自骨髓或血液）制备单核细胞悬液。使用缓冲液将 MNC 稀释至 1-2 x 10⁷ 个细胞/mL 的浓度。在冰上保存。

全血和血沉棕黄层

冷却 5 mL 抗凝全血（EDTA 或 ACD）。在冰上保存。2.3 阳性分离肿瘤细胞 MNC

1. 向每 1 mL MNC 细胞样本添加 25 μL (1 x 10⁷) 洗涤后的 Dynabeads Epithelial Enrich，然后在 2-8°C 下将其置于滚筒上30分钟。


2. 在 2-8°C 下，将试管放入磁铁3分钟。1分钟后，轻轻翻转含有试管的磁铁以收集留在管盖中的微珠。


3. 用移液管小心去除上清液。


4. 加入 800 μL 低温缓冲液（含 0.1% BSA 和 0.6% 柠檬酸钠的 PBS）。从磁铁中取出试管，小心重悬微珠结合细胞并将悬液转移到新试管中。


5. 将试管放在磁铁上3分钟。在不搅动微珠团块的情况下去除上清液。


6. 向试管中加入 800 μL 低温缓冲液并从磁铁上取下试管。通过吹打轻轻重悬微珠/细胞复合物。


7. 重复第5步和第6步三次，即总共洗涤5次。


8. 将微珠悬液转移到新试管中。在冰上保存以立即用于下游应用

全血和血沉棕黄层

1. 向每 5 mL 血液样本添加 125 μL (5 x 10⁷) 洗涤后的 Dynabeads Epithelial Enrich，然后在 2-8°C 下将其置于滚筒上30分钟。


2. 在 2-8°C 下，将试管放入磁铁5分钟。3分钟后，翻转含有试管的磁铁以收集留在管盖中的微珠。


3. 用移液管小心去除血液上清液。


4. 当试管仍在磁铁上时，加入 1 mL 低温缓冲液（含 0.1% BSA 和 0.6% 柠檬酸钠的 PBS），以去除留在试管中和管壁上的血液。避免搅动微珠团块。


5. 丢弃缓冲液。


6. 加入 800 μL 低温缓冲液。从磁铁中取出试管并小心重悬微珠结合细胞。


7. 将悬液转移到新试管中。


8. 将试管放入磁铁3分钟。去除上清液。


9. 向试管中加入 800 μL 低温缓冲液并从磁铁上取下试管。通过吹打轻轻重悬微珠/细胞复合物。


10. 将试管放入磁铁3分钟。


11. 重复第9-10步三次，即总共洗涤5次。


12. 将微珠悬液转移到新试管中。在冰上保存以立即用于下游应用（请参阅分离或去除全血、血沉棕黄层、骨髓、MNC、组织样本中的人上皮细胞）。 

1. Hempel D et al.Efficacy of monoclonal antibody (MOAB) HEA125 in enrichment of cancer cells from bone marrow and stem cell collections for quantification of minimal residual disease load and further immunocytochemical characterization of cancer cells.Stem Cell Transplantation, San Diego, April 1996.


2. Wu H et al.(2005) Hypomethylation-linked activation of PAX2 mediates tamoxifen-stimulated endometrial carcinogenesis.Nature.438: 981-987.


3. Hardingham JE et al.(1995) Detection of circulating tumour cells in colorectal cancer by immunobead- PCR is a sensitive prognostic marker for relapse of disease.Molecular Medicine.1(7):789-794.


4. Hardingham JE et al.(1993) Immunobead- PCR: A technique for the detection of circulating tumor cells using immunomagnetic beads and the polymerase chain reaction.Cancer Research.53:3455-3458.


5. Cremoux P et al.(2000) Detection of MUC1-expressing mammary carcinoma cells in the peripheral blood of breast cancer patient by realtime polymerase chain reaction.Clin. cancer research.6 (8):3117-3122.


6. Sakaguchi M et al.(1999) Development of a sensitive, specific reverse transcriptase polymerase chain reaction-based assay for epithelial cells in effusions.British Journal of Cancer.79(3/4):416-422.


7. Park et al.(2001) Immunobead RT-PCR versus regular RT-PCR amplification of CEA mRNA in peripheral blood.J Cancer Res Clin Oncol.127:489.


8. Guo J et al.(2005) Detection of cytokeratin 20 mRNA in the peripheral blood of patients with colorectal cancer by immunomagnetic bead enrichment and real-time reverse transcriptase– polymerase chain reaction.Journal of Gastroenterology and Hepatology.20:8,1279.


9. LR Gauthier et al.(2001) Detection of circulating carcinoma cells by telomerase activity.Br. J. Cancer.84 (5):631-635.


10. J-C Soria et al.(1999) Molecular detection of telomerase-positive circulating epithelial cells in metastatic breast cancer patients.Clinical Cancer Research.5:971-975.


11. Naume B et al.(1997) Immunomagnetic techniques for enrichment and detection of isolated breast carcinoma cells in bone marrow and peripheral blood.Journal of Hematotherapy.6:103-113.


12. Latza U et al.(1990) Ber-EP4: new monoclonal antibody which distinguishes epithelia from mesothelia.J. Clin.Pathol.43: 213-219.

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