人外周血 CD4+ T 淋巴细胞的快速定量

• 用吖啶橙染色后在荧光显微镜中观察
• 用 Sternheimer-Malbin 溶液或 Turck 溶液染色后在常规光学显微镜中观察。结果显示了每微升全血中的细胞数量。

• 2 mL Dynabeads CD14（蓝色标记）：用于去除单核细胞，包被了对单核细胞的 CD14 抗原具有特异性的小鼠单克隆抗体
• 2 mL Dynabeads CD4（黄色标记）：用于分离 CD4⁺ T 细胞，包被了对 CD4⁺ T 细胞亚群的 CD4 抗原具有特异性的小鼠单克隆抗体 7 mL 裂解液：设计用于病毒和释放淋巴细胞核。（含甲醛 – 小心使用）
• 该试剂盒足以进行80次 125 μL 全血的检测

• 磁铁：Dynal MPC™-S（货号 120.20D）
• 兼具倾斜和旋转功能的混合器（例如 Dynal MX1，货号 159.07）。
• 用于分离 CD8⁺ T 淋巴细胞的 Dynabeads CD8（货号 111.47D）。
• 吖啶橙染色液：与荧光显微镜（货号 930.01）配合使用。
• Sterheimer-Malbin 染色液：与光学显微镜（货号 930.04）配合使用
• Turck 染色液：与光学显微镜（货号 930.05）配合使用。
• 微量离心管（货号 930.02）或 Rhesus 管&盖（货号 930.06）
• Mallassez 血球计数器（货号 995.03）。
• PBS-BSA-叠氮化钠洗涤/稀释缓冲液（货号9408）。

• 吖啶橙染色液

• 储备溶液：

• 工作溶液

• Sternheimer-Malbin 染色液：

• Turck 染色液：

• 洗涤/稀释缓冲液

• 含抗凝剂（ACD 或 EDTA）的采血管。
• 移液器（容量范围：25 μL – 500 μL）。
• 封口膜。
• 荧光显微镜、光学显微镜。

细胞分离程序

• 血液样本应尽可能新鲜，最好不超过24小时。血液样本在 2-8°C 或室温下储存长达24小时后，细胞计数未显著下降。
• 将肝素用作抗凝剂时，在血液样本中观察到纤维蛋白沉淀。肝素还会使血小板活化。Invitrogen Dynal 不建议将肝素用作本程序的抗凝剂。

去除单核细胞

1. 在含有 ACD 或 EDTA 的标准采血管中采集血液。在室温下孵育至少5分钟，同时轻轻倾斜和旋转试管。


2. 重悬 Dynabeads CD14 以获得均匀分散溶液。


3. 在试管中加入以下各项：
   • 350 μL 洗涤/稀释缓冲液
   • 125 μL 血液
   • 25 μL Dynabeads CD14




4. 盖上试管盖并小心混合样本。在室温下使用样本混合器（如 MX1）孵育样本10分钟，同时轻轻倾斜和旋转试管


5. 孵育后，摇落留在管盖下的任何血滴。小心地取下并弃置管盖。将试管放入磁铁2分钟。


6. 将 200 μL 已去除单核细胞的血液（上清液）转移到另一支试管中，不要搅动被磁铁留在管壁上的细胞。（对于 CD8⁺ T 细胞定量，将另一份 200 μL 样本转移到另一支试管以分离 CD8⁺ T 细胞）。丢弃装有单核细胞的初始样本管。

分离 CD4⁺ T 细胞

对于微量离心管（货号 930.02），将一张封口膜折叠三次后放在试管和管盖之间，以免血液滞留在管盖的孔中。如果试管留在磁铁中超过5分钟，可能会出现沉淀，进而影响转移的 T4 细胞数量。在这种情况下，使用微量移液器通过此试管的样本孔轻轻重悬，然后再收集 200 μL 等份试液以进行 CD4⁺ T 淋巴细胞分离。

1. 向装有 200 μL 已去除单核细胞的血液的试管中加入 200 μL 洗涤/稀释缓冲液。


2. 使用前，重悬 Dynabeads CD4（黄色标记）以使微珠在悬浮液中均匀分散。


3. 向试管中加入 25 μL Dynabeads CD4。


4. 盖上试管盖并小心混合样本。在室温下孵育10分钟，同时轻轻倾斜和旋转试管。


5. 孵育后，摇落留在管盖下的任何血滴。小心丢弃管盖。将试管放入磁铁2分钟以分离与微珠结合的 CD4⁺ T 细胞。


6. 在细胞仍被磁铁吸附在管壁上时，丢弃上清液。避免搅动微珠结合细胞。


7. 从磁铁上取下磁铁滑块并向试管中加入 500 μL 洗涤/稀释缓冲液，借此洗涤分离的 CD4⁺ T 细胞。在试管上放置一张预先裁剪好的封口膜。旋转试管几次，直至微珠结合细胞完全重悬 


8. 小心丢弃封口膜。将磁铁滑块重新装入磁铁2分钟以分离与微珠结合的 CD4+ T 细胞。我们建议不熟悉此技术的用户再进行一次洗涤程序。

CD4⁺ T 淋巴细胞计数

建议通过2种不同的备选方法进行 CD4⁺ T 细胞计数：

备选方法 A：荧光显微镜血球计数器读数

备选方法 B：光学显微镜血球计数器读数

• 在少数情况下 (<2%)，观察到分离的 CD4⁺ T 淋巴细胞存在多形核粒细胞污染，此情况下的细胞计数超出 CD4⁺ T 细胞计数正常范围几个百分比。由于此类粒细胞的细胞核形状比较有特点，因此在显微镜下可以轻松发现此类严重的粒细胞污染。

备选方法 A：荧光

显微镜血球计数器读数

1. 完全去除最后的洗涤缓冲液。避免搅动管壁上的分离微珠。从磁铁上取下磁铁滑块并使用 50 μL 裂解液冲掉管壁上的所有微珠结合细胞。通过旋晃充分重悬。


2. 让样本在室温下放置5分钟。


3. 加入 50 μL 吖啶橙染色液。在 2-8°C 下避光储存样本，直至计数。应在加入裂解液后一小时内对样本进行计数。 


4. 旋晃5秒以充分重悬样本。将约 20 μL 悬浮液转移到血球计数器上，然后使用同时具有蓝色 (450/490 nm) 激发光和白光的荧光显微镜显现网格，以计算已知体积中的细胞数量。如果血球计数器小室中的细胞少于100个，请重复计数并取两次计数的平均值。

样本中裂解的 CD4⁺ T 细胞浓度相当于全血中 CD4⁺ T 细胞浓度的一半。

使用以下公式将血球计数器中计算的细胞数量转换为全血中 CD4⁺ T 细胞的浓度：

细胞/μL = n × 2
                   v
n = 计算的细胞数量
V = 血球计数器中的计数体积（以微升表示）。

备选方法 B：光学显微镜

血球计数器读数

本试剂盒不含染色液。请在以下程序中使用 Sternheimer-Malbin 或 Turck 染色液。

用 Sternheimer-Malbin 溶液染色                                                                                                                        返回顶部

1. 完全去除最后的洗涤缓冲液。从磁铁上取下磁铁滑块并使用 80 μL 裂解液冲掉管壁上的所有微珠结合细胞。通过旋晃充分重悬。


2. 让样本在室温下放置5分钟。


3. 加入 20 μL Sternheimer-Malbin 染色液。在 2-8°C 下避光储存样本，直至计数。在加入裂解液后一小时内对样本进行计数。


4. 旋晃5秒以充分重悬。将约 20 μL 悬浮液转移到血球计数器上，然后使用常规的白光显微镜计算已知体积中的细胞数量。如果血球计数器小室中的细胞少于100个，请重复计数并取两次计数的平均值。

样本中裂解的 CD4⁺ T 细胞浓度相当于全血中 CD4⁺ T 细胞浓度
的一半。

使用以下公式将血球计数器中计算的细胞数量转换为全血中 CD4⁺ T 细胞的浓度：

细胞/μL = n × 2
                   v
n = 计算的细胞数量
V = 血球计数器中的计数体积（以微升表示）。

用 Sternheimer-Malbin 染色液染色的细胞核在白光显微镜下呈紫色。与吖啶橙染色相比，这些样本的可辨度较低。因此，使用光学显微镜计数时，需要较高的视觉敏锐度，而且应减少执行的样本数量。

用 Turck 溶液染色

1. 完全去除最后的洗涤缓冲液。从磁铁上取下磁铁滑块并使用 50 μL 裂解液冲掉管壁上的所有微珠结合细胞。通过旋晃充分重悬。


2. 让样本在室温下放置5分钟。


3. 加入 50 μL Turck 染色液。在 2-8°C 下避光储存样本，直至计数。在加入裂解液后一小时内对样本进行计数。


4. 旋晃5秒以充分重悬样本。将约 20 μL 悬浮液转移到血球计数器上，然后使用常规的白光显微镜计算已知体积中的细胞数量。如果血球计数器小室中的细胞少于100个，请重复计数并取平均值。样本中裂解的 CD4⁺ T 细胞浓度相当于全血中 CD4⁺ T 细胞浓度的一半。

通过以下公式将血球计数器中计算的细胞数量转换为全血中 CD4⁺ T 细胞的浓度：

细胞/μL = n × 2
                   v
n = 计算的细胞数量
V = 血球计数器中的计数体积（以微升表示）。

用 Turck 溶液染色的细胞核在白光显微镜下呈紫色。与吖啶橙染色相比，这些样本的可辨度较低。因此，使用光学显微镜计数时，需要较高的视觉敏锐度，而且应减少执行的样本数量。

结果判读

CD4⁺ T 淋巴细胞定量是评估免疫缺陷疾病（例如，无丙种球蛋白血症、获得性免疫缺陷综合征 (AIDS) 和胸腺发育不全）进展情况的最佳指标之一。CD4⁺ T 淋巴细胞减少会带来重大风险，当每 μL 血液中的 CD4⁺ T 细胞数量低于200时，就会罹患机会性疾病。

质量保证

对于所有常规实验室工作，建议采用质量保证程序。

内部质量控制：

表2 – 流式细胞分析与 Dynal T4 定量试剂盒在健康个体中的相关性。

在这43个人中，一人的值高于第97.5百分位数，一人低于第2.5百分位数。表3和4提供了 Dynal T4 定量试剂盒在男性、女性以及各年龄组中的参考区间。

表3 – CD4⁺ T 淋巴细胞定量的 95% 参考区间（按性别列）

表4 – CD4⁺ T 淋巴细胞定量的 95% 参考区间（按年龄列）

每个实验室都应基于当地人群确立自己的正常参考区间

1. Wood GS. et al.(1983) Anti Leu-3/T4 antibodies react with cells or monocyte/macrophage and langerhans


2. lineage.J. Immunol.131, 212-216.


3. Stewart SJ. et al.(1986) Human T lymphocytes and monocytes bear the same Leu-3 (T4) antigen.J. Immunol.136 3773-3778.


4. Lyamuya, E.F. et al.(1996) Evaluation of the FACS count, TRAx CD4 and Dynabeads methods for CD4 lymphocytes determination.J. Imm.Methods 195: 103-112.


5. Didier, J.M. et al.(2001) Comparative assessment of alternative methods for CD4⁺ T lymphocytes enumeration in developing countries.JAIDS 26 (2).


6. Crowe, S. et al.(2003) Monitoring of human immunodeficiency virus infection in resource-constrained countries.Clin.Infect.Dis.37 (Suppl1) : 25-35.


7. Diagbouga, S. et al.(2003) Successful implementation for a low-cost method for enumerating CD4⁺


8. Besson-Faure I. et al.(1993) Numération des lymphocytes CD4 et CD8: Etude d’une nouvelle technique par immunoséparation magnétique.


9. Poncelet P. et al.(1993) Numération des lymphocytes CD4⁺ et CD8⁺ après immunoséparation magnétique.Conférence de Gonsensus l’immunophénotypage lymphocytaire au cours de l’infection à VIHAvril 1993.