人 DC 富集试剂盒

使用本产品，通过去除 T 细胞、B 细胞、单核细胞/巨噬细胞、NK 细胞、红细胞以及大多数粒细胞，从血液单核细胞中富集未接触的树突状细胞 (DC)。富含 DC 的细胞群无微珠和抗体，适合通过流式分选进一步分离任何 DC 亚群。本试剂盒能以较高的回收率回收谱系特异性标记物 (Lin-) CD4 ⁺ 细胞，因此适用于进一步分离任何 DC 亚群，如骨髓和浆细胞样 DC。

分离原理

向起始样本中加入抗非 DC 细胞的生物素化单克隆抗体混合物。加入 Depletion MyOne™ SA Dynabeads，让它们在短暂的孵育过程中结合非 DC。用磁铁分离微珠结合细胞。丢弃微珠结合细胞并使用剩余的未接触富集细胞群进行进一步流式分选，以获得感兴趣的 DC 亚群

材料描述

提供的材料

• 20 mL Depletion MyOne SA Dynabeads

Depletion MyOne SA Dynabeads 是均匀的超顺磁性聚苯乙烯微珠（直径 1.0 μm），包被了
链霉亲和素 (SA)。以 pH 7.4、含 0.1% 牛血清白蛋白 (BSA) 和 0.02% 叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 的形式提供，浓度为 10 mg 微珠/mL。

• 用于 DC 试剂盒的 4 mL 抗体混合物

抗体混合物含有抗 CD3、CD14、CD16、CD19、CD56 和血型糖蛋白 A 的生物素化单克隆抗体的优化混合物，以 pH 7.4、含 0.02% 叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 的形式提供。 本试剂盒将处理 2 x 10⁹ 个单核细胞。

所需的其他材料

• 磁铁：(Dynal MPC™)，MPC-L 适用于 1-5 mL 样本，MPC-15 适用于 1-15 mL 样本，MPC-50 适用于 15-50 mL 样本。
• 兼具倾斜和旋转功能的混合器。
• 缓冲液1：含 0.1% BSA 和 2 mM EDTA 的 PBS（不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺），pH 7.4。
• 缓冲液2：PBS pH 7.4（不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺）。
• Lymphoprep

重要提示：

• 在富集步骤中，务必让缓冲液保持低温 (2-8˚C)。
• 不建议使用含 Ca²⁺ 或 Mg²⁺ 的 PBS。
• 请勿使用含生物素的缓冲液或添加剂（如 FCS），因为这可能会降低去除效率。
• 使用可以倾斜和旋转试管的混合器，确保 Dynabeads 不会沉淀在管底。
• 请遵循磁铁建议，确保成功分离。

Dynabeads 洗涤程序

使用前，应先洗涤 Dynabeads。

1. 在小瓶中重悬 Dynabeads。


2. 将所需体积的 Dynabeads 转移至试管中。


3. 加入相同体积或至少 1 mL 的缓冲液1并混合。


4. 将试管放入磁铁3分钟并丢弃上清液。


5. 从磁铁中取出试管，在体积与第2步中从小瓶中转移的初始体积相同的缓冲液1中重悬洗过的 Dynabeads。

样本制备

从血沉棕黄层制备 MNC 以获得较低数量的血小板

  1.   在室温下，使用缓冲液2将 10-18 mL 血沉棕黄层稀释至总体积为 35 mL。

  2.   在 15 mL Lymphoprep 上添加稀释后的血沉棕黄层。

  3.   在 20°C 下以 160 × g 的速度离心20分钟。在不使用制动器的情况下让其减速。

  4.   移除 20 mL 上清液以去除血小板。

  5.   在 20°C 下以 350 × g 的速度离心20分钟。在不使用制动器的情况下让其减速。

  6.   从血浆/Lymphoprep 分界面回收 MNC 并将细胞转移至 50 mL 试管中。

  7.   在 2-8°C 下，使用缓冲液1通过以 400 x g 的速度离心8分钟的方式洗涤 MNC 一次。

  8.   在 2-8°C 下，使用缓冲液1通过以 225 x g 的速度离心8分钟的方式洗涤 MNC 两次，然后以 1 x 10 ⁸ 个 MNC/mL 的浓度在缓冲液1中重悬 MNC。

富集 DC

• 在此方案中，使用了 1 x 10⁷ 个白细胞 (MNC) 进行富集。细胞数量可以从 1 x 10⁷ 增加到 2 x 10⁹（见表1）。
• 在整个过程中，让细胞和缓冲液保持低温 (2-8°C)。
  
  

1. 将缓冲液1中的 100 μL (1 x 10⁷) 白细胞转移到试管中。


2. 加入 20 μL 抗体混合物。


3. 混合均匀并在 2-8°C 下孵育20分钟。


4. 加入 2 mL 缓冲液1来洗涤细胞。倾斜试管几次以混合均匀，并在 2-8°C 下以 300 x g 的速度离心10分钟。丢弃上清液。


5. 在 900 μL 缓冲液1中重悬细胞。


6. 加入 100 μL 经过预洗涤的 Depletion MyOne SA Dynabeads。


7. 在 2-8°C 下孵育15分钟，同时轻轻倾斜和旋转试管。


8. 通过充分吹打或旋晃5秒来重悬微珠结合细胞。


9. 加入 1 mL 缓冲液1。


10. 将试管放入磁铁3分钟。


11. 将上清液转移到新试管中。

上清液含有富含 DC 的细胞群。

表1.DC 富集的体积要求。


处理其他数量的细胞时，请相应地增加所有试剂和体积。

下游应用

富含 DC 的细胞群可用于通过流式分选进一步分离 DC 亚群以达到高纯度。

Invitrogen Dynal AS 符合质量体系标准 ISO 9001:2000 和 ISO 13485:2003。

储存/稳定性

如在未开封的情况下储存于 2-8°C 下，在标签上注明的失效日期前，本产品可一直保持稳定。请在 2-8°C 下储存已开封的小瓶并避免细菌污染。在储存期间和所有操作步骤中，始终让 Dynabeads 处于悬浮液中，因为干燥会导致性能降低。使用前，请充分重悬。

警告和限制

本产品仅用于研究目的。除非另有说明，否则不得用于任何动物或人的治疗或诊断。请遵循适当的实验室指南。本产品含有 0.02% 叠氮化钠（作为防腐剂，具有细胞毒性）。

不要用嘴吹打！

叠氮化钠可与铅和铜管发生反应，形成极易爆炸的金属叠氮化物。通过管道排放进行处置时，请用大量水冲洗，以防止叠氮化物积聚。分析证书 (CoA) 可应要求提供。材料安全数据表 (MSDS) 可在 获得。

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