磁性分离人单核细胞 (MNC) 中的 CD4+ CD25+ 调节性 T 细胞

本方案适用于磁性分离人单核细胞 (MNC) 中的 CD4⁺CD25⁺ 调节性 T 细胞。CD4⁺CD25- 细胞部分可在下游的抑制试验中用作效应细胞。提供的方案描述了从 1 x 10⁸ 个 MNC 中磁性标记和分离细胞的步骤。第一步，使用抗体混合物人 CD4 标记非 CD4⁺ MNC。第二步，添加 Depletion MyOne Dynabeads® 以去除非 CD4⁺ MNC。第三步，向 CD4⁺ T 细胞中加入 Dynabeads® CD25 以捕获 CD4⁺CD25⁺ T 细胞。最后一步，去除细胞中的 Dynabeads® CD25。

下游应用

分离的细胞可直接用于任何下游应用，包括流式细胞分析和细胞扩增方案。

所需的其他材料

不包含但执行整个方案需要的材料：

• 分离缓冲液：添加了 0.1% BSA 和 2mM EDTA 且不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS)，例如Gibco 货号14190-094（有关更多信息，请参阅技术建议）。
• 胎牛血清 (FBS)
• 培养基：含 1% FBS 的 RPMI 或等效产品
• 兼具倾斜和旋转功能的混合器。
• 磁铁。
• 流式细胞分析抗体试剂（可选）。推荐产品和方案。

重要提示

• 使用可以倾斜和旋转试管的混合器，确保 Dynabeads® 不会沉淀在管底。
• 本产品不可与 Dynal® MPC-1 磁铁（货号 120.01D）配合使用
• 切勿使用少于推荐体积的 Dynabeads®。
• 请小心遵循推荐的移液体积和孵育时间。
• 移液时，避免出现气泡。
• 使用荧光偶联一抗进行流式细胞分析。避免使用对小鼠抗体具有特异性的二抗进行流式细胞分析染色。

CD4⁺ T 细胞群中约有 3-10% 的细胞表达 CD25 抗原。此试剂盒可分离表达细胞内转录因子 FOXP3 的高纯度 CD4⁺ CD25⁺ 调节性 T 细胞。本方案描述了使用 Dynabeads® 调节性 CD4⁺CD25⁺ T 细胞试剂盒从 1x10⁸ 个人单核细胞 (MNC) 中磁性标记和分离 CD4⁺CD25⁺ 调节性 T 细胞的步骤。

制备

• 按标准程序分离抗凝外周血或富含白细胞的血沉棕黄层中的 MNC（有关更多信息，请参阅技术建议）。
• 制备分离缓冲液和含 1% FBS 的 RPMI。

分离程序

当处理的细胞少于 1 x 10⁸ 个时，请使用以下所示的体积。处理更多细胞时，请相应增加所有试剂体积和总体积。

1. 在 500 μL 分离缓冲液中重悬 1 x 10⁸ 个 MNC 并加入 200 μL FBS 和 200 μL 抗体混合物人 CD4。混合均匀并在 2-8°C 下孵育20分钟。


2. 加入 10 mL 低温分离缓冲液来洗涤细胞，然后以 350 x g 的速度离心8分钟。


3. 去除并丢弃上清液。


4. 向细胞团块中加入 2 mL 低温分离缓冲液并重悬。


5. 加入 1 mL 重悬后的 Depletion MyOne Dynabeads® 并混合均匀。在室温下，以滚动、倾斜的方式孵育15分钟。


6. 使用窄口移液器（如 1000 μL 移液器吸头或 5 mL 血清移液器）用力吹打5次来重悬微珠结合细胞。


7. 加入 3 mL 分离缓冲液。


8. 将试管放入磁铁3分钟。


9. 将含有无微珠 CD4⁺ T 细胞的上清液转移到新试管中。


10. 使用装有上清液的试管重复第 8-9 步，以去除残留的 Depletion MyOne Dynabeads®。


11. 以 350 x g 的速度离心处理细胞8分钟，然后在分离缓冲液中将细胞重悬至 1.5 x 10⁷ 个细胞/mL 的浓度。


12. 每 1.5 x 10⁷ 个 CD4⁺ 细胞加入 200 μL Dynabeads® CD25。


13. 混合均匀并在 2-8°C 下以滚动、倾斜的方式孵育25分钟。


14. 将试管放入磁铁至少1分钟。小心去除含有 CD4⁺CD25-（效应）细胞的上清液。


15. 从磁铁中取出试管，通过轻轻摇晃试管而非吹打细胞的方式在 5 mL 分离缓冲液中小心地重悬微珠结合细胞。


16. 将试管放入磁铁至少1分钟。去除并丢弃上清液。


17. 在 5 mL 分离缓冲液中小心地重悬细胞并轻轻摇晃试管，借此再洗涤一次。


18. 将试管放入磁铁至少1分钟。去除并丢弃上清液。


19. 在 500 μL 含 1% FBS 的 RPMI 中重悬微珠结合细胞


20. 加入 80 μL DETACHaBEAD，在室温下孵育45分钟，同时倾斜和旋转试管。


21. 将试管放入磁铁至少1分钟。将含有 CD4⁺CD25⁺ 细胞的上清液小心地移到新试管中。


22. 在 1 mL 含 1% FBS 的 RPMI 中洗涤 Dynabeads® CD25 两次以获得残留细胞，并在磁性分离后收集上清液。


23. 加入 10 mL 含 1% FBS 的 RPMI 来洗涤细胞，然后以 350 x g 的速度离心8分钟。执行此洗涤步骤两次。


24. 丢弃上清液并在首选细胞培养基中重悬细胞。了解更多信息

分离缓冲液

添加了 0.1% BSA 和 2 mM EDTA 的 Gibco PBS（磷酸盐缓冲盐水）（货号 14190-094）。 
如果您愿意，可以使用含 2% 胎牛血清和 1 mM EDTA 的 PBS。

从血沉棕黄层制备 MNC

这种方法得到的血小板数量较低，因此建议与 Dynabeads® 调节性 CD4⁺CD25⁺ T 细胞试剂盒配合使用。

1. 在 18-25°C 下，使用含 0.1% BSA + 0.6% 柠檬酸钠或 2 mM EDTA 的 PBS 将 10-18 mL 血沉棕黄层稀释至总体积为 35 mL。


2. 在 15 mL Lymphoprep™ 上添加稀释后的血沉棕黄层。


3. 在 20°C 下，以 160 x g 的速度离心20分钟。在不使用制动器的情况下让其减速。


4. 移除 20 mL 上清液以去除血小板。


5. 在 20°C 下，以 350 x g 的速度离心20分钟。在不使用制动器的情况下让其减速。


6. 从血浆/Lymphoprep 分界面回收 MNC 并将细胞转移至 50 mL 试管中。


7. 在 2-8°C 下，使用含 0.1% BSA 的 PBS 通过以 400 x g 的速度离心8分钟的方式洗涤 MNC 一次。


8. 在 2-8°C 下，使用含 0.1% BSA 的 PBS 通过以 225 x g 的速度离心8分钟的方式洗涤 MNC 两次，然后以 2 x 10⁸ 个 MNC/mL 的浓度在分离缓冲液中重悬 MNC。

如果起始样本并非血沉棕黄层，请参阅推荐的 MNC 制备程序。如需更多技术信息，请联系 Invitrogen Dynal®（请参阅详细联系信息）。

Invitrogen Dynal® AS 符合质量体系标准 ISO 9001:2000 和 ISO 13485:2003。

材料描述
Depletion MyOne Dynabeads® 是均匀的超顺磁性聚苯乙烯微珠（直径 1 μm）。Dynabeads® CD25 是均匀的超顺磁性聚苯乙烯微珠（直径 4.5 μm）。抗体混合物人 CD4 含有小鼠 IgG 抗体 CD14、CD16（对 CD16a 和 CD16b 具有特异性）、CD56、CDw123、CD36、CD8、CD19 和血型糖蛋白 A。以含有 0.02% 叠氮化钠 (NaN₃) 的 PBS 的形式提供。

储存/稳定性

如在未开封的情况下储存于 2-8°C 下，在标签上注明的失效日期前，本产品可一直保持稳定。请在 2-8°C 下储存已开封的小瓶并避免细菌污染。在储存期间和所有操作步骤中，始终让 Dynabeads® 处于悬浮液中，因为干燥会导致性能降低。使用前，请充分重悬。

警告和限制

本产品仅用于研究目的。除非另有说明，否则不得用于任何动物或人的治疗或诊断。请遵循适当的实验室指南。本产品含有 0.02% 叠氮化钠（作为防腐剂，具有细胞毒性）。

不要用嘴吹打！

叠氮化钠可与铅和铜管发生反应，形成极易爆炸的金属叠氮化物。通过管道排放进行处置时，请用大量水冲洗，以防止叠氮化物积聚。分析证书 (CoA) 可应要求提供。材料安全数据表 (MSDS) 可在 获得。