HCSおよびHCAのサンプルデータ

新しいCellInsight CX7 Pro Platformを使用することで可能になるハイスループットイムノアッセイスクリーニング

CellInsight CX7とCX7 Pro機器間のFirePlex™-HT no-washiイムノアッセイの比較。ハイスループットスクリーニング用に最適化されたno-wash FirePlexアッセイをメーカーのプロトコルに従って実施し、ウェルあたり5および10の分析対象物を検出しました。分析対象物の再現性とダイナミックレンジ幅をアッセイするために、10点からなる標準曲線を作成し、定量しました。結果として得られたアッセイを、CellInsight CX7（左の画像）またはCX7 Pro（右の画像）プラットフォームのいずれかを使用して測定し、FirePlex Analysis Workbench Softwareを使用して定量しました。CX7 Pro機器（右の画像）のみが、ダイナミックレンジ2.5（15-bit）または3.0（16-bit）を超えることができ、プレート内CVは15%未満でした。ダイナミックレンジと再現性性能の大幅な向上は、CX7 Pro機器の優れた光学系と95%のQE検出能によるものです。この実験は、HTスクリーニングを考慮して、15-および16-bit CX7 Pro sCMOSカメラモードの両方を使用してAbcam™により検証しました。

がん免疫学アプリケーション：乳がんスフェロイドにおける抗体依存性細胞致死のイメージング

乳がんスフェロイドにおける抗体依存性細胞致死。Dynabeads Untouched Human NK Cells Kitで分離したヒトNK細胞をCellTracker Deep Red Dyeで標識しました。ヒト乳がん細胞（SKBR3）をNunclon Sphera 96ウェルプレートで一晩培養してスフェロイドを形成させ、抗HER2抗体Trastuzumabで処理し、その後、NK細胞に4時間暴露させました。細胞をCellEvent Caspase-3/7 Green Detection ReagentとHoechst 33342で染色し、CellInsight CX7 LZR High-Content ScreeningPlatformでイメージングしました。画像は複数のZ断面の最大強度を投影したものです。CellEvent Caspase-3/7 Green Detection Reagentを使用して、スフェロイド中のNK細胞および抗体媒介アポトーシスを研究しました。CellTracker Deep Redはスフェロイド内のNK細胞の追跡に使用しました。SKBR3細胞のHER2に結合したトラスツズマブは、抗体依存性細胞アポトーシスによりNK細胞抗腫瘍反応を増幅させています。

スフェロイドイメージングおよび解析アプリケーション：EdUの増殖とスフェロイドサイズのセグメンテーションと定量

CellInsight CX7 LZRシステムを使用したEdUおよびスフェロイドサイズのセグメンテーションと定量。A549細胞をNunclon Sphera 96Uウェルマイクロプレートにウェルあたり5,000細胞の密度で播種し、CO2インキュベーターで24時間インキュベートしました。EdUを最終濃度が10 µMになるように添加し、1時間インキュベートしました。その後、スフェロイドを4%ホルムアルデヒドで洗浄および固定し、0.25% Triton X-100で透過処理しました。Click-iT EdU Alexa Fluor 488 HCS Assay Kitを使用して、キットのプロトコルに従いスフェロイドをEdU用に染色しました。CellInsight CX7 LZR High Content Screening Platformで共焦点モードを使用して、プレートを4x対物レンズでイメージングしました。画像は200枚の光学zスライス（各1ミクロン）の最大強度を投影したものです。Morphology Explorer BioApplicationを使用したHCS Studio 2.0 Softwareで定量しました。スフェロイドを1つの対象物としてセグメンテーションし、EdU陽性細胞はスフェロイド内のスポットとしてカウントしました。Morphology Explorer BioApplicationを使用して、スフェロイドを対象物全体としてセグメンテーションし、EdU陽性細胞はスフェロイド内でセグメンテーションして細胞数をプロットしました。

BioApplicationの生細胞モードでの3Dスフェロイドの共焦点イメージング

生細胞モードでの3Dスフェロイドの共焦点イメージング。（A）A549細胞をU底プレートに5,000／ウェルの密度で播種し、CO2インキュベーターで48時間インキュベートしました。LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kitを使用して、生スフェロイドの生細胞および死細胞を標識しました。CellInsight CX7 LZR HCS機器で共焦点を使用して、プレートを10x対物レンズで自動イメージングしました。画像は複数のZ断面の最大強度を投影したものです。染色した死細胞はスフェロイドのコア（赤）で観察され、生細胞（緑）はスフェロイドの周囲で観察されました。（B）A549細胞をU底プレートに5,000／ウェルの密度で播種し、CO2インキュベーターで24時間インキュベートしました。その後、生スフェロイドをMitoTracker Orange CMTMRosおよびCellEvent Caspase-3/7 Green Detection Reagentで30分間染色しました。CellInsight CX7 LZR HCS機器で共焦点を使用して、プレートを10x対物レンズで自動イメージングしました。画像は複数のZ断面の最大強度を投影したものです。A549スフェロイドでは、MitoTracker Orange染色で見られるようにほとんどの細胞は健康で、アポトーシス細胞はほとんど観察されませんでした。（C）A549細胞をU底プレートに5,000／ウェルの密度で播種し、CO2インキュベーターで24時間インキュベートしました。その後、スフェロイドをImage-iT Green Hypoxia Reagentで30分間染色しました。CellInsight CX7 LZR HCS機器で共焦点を使用して、10x対物レンズでプレートを自動イメージングしました。画像は複数のZ断面の最大強度を投影したものです。A549スフェロイドは、Image-iT Green Hypoxia Reagentによる染色として観察される低酸素状態を示しています。（D）SKBR3細胞をU底プレートに5,000／ウェルの密度で播種し、CO2インキュベーターで24時間インキュベートしました。その後、スフェロイドをpHrodo Red標識のHerceptin抗体とともに24時間インキュベートしました。CellInsight CX7 LZR HCS機器で共焦点を使用して、プレートを4x対物レンズで自動イメージングしました。画像は複数のZ断面の最大強度を投影したものです。内在化したpHrodo標識のHerceptin抗体が細胞内小胞で観察されます。（E）Culture One Supplementを添加したNeurobasal Plus Medium中で、神経幹細胞（NSC）からニューロスフェアを分化させました。その後、ニューロスフェアをTubulin Tracker Deep Redで1時間染色しました。CellInsight CX7 LZR HCS機器で共焦点を使用して、プレートを4x対物レンズで自動イメージングしました。画像は複数のZ断面の最大強度を投影したものです。Tubulin Tracker Deep Redは、神経幹細胞から分化したニューロスフェアの突起を染色します。（F）HeLa細胞をU底プレートに5,000／ウェルの密度で藩主し、CO2インキュベーターで24時間インキュベートしました。活性化T細胞をCellTracker Deep Redで標識し、約5,000個の細胞を各ウェルに添加しました。スフェロイドを活性化T細胞と2時間インキュベートした後、pHrodo Green AM Intracellular pH Indicatorで30分間染色しました。細胞をPBSで3回洗浄し、CellInsight CX7 LZR HCS機器で共焦点を使用して、4x対物レンズでイメージングしました。画像は複数のZ断面の最大強度を投影したものです。活性化T細胞を添加すると、pHrodo Green AMの蛍光が細胞内で増加します。

スフェロイド中の増殖細胞のイメージングと解析

HeLaスフェロイド中の増殖細胞の解析。HeLa細胞をNunclon Sphera U底プレートに5,000／ウェルの密度で播種し、CO2インキュベーターで24時間インキュベートしました。スフェロイドを50 µMのhydroxyureaで24時間処理しました。その後、スフェロイドを10 µMの5-ethynyl-2’-deoxyuridine（EdU）とともに30分間振動させました。スフェロイドをPBSで洗浄し、Click-iT EdU Alexa Fluor 488 HCS Assayを使用して増殖細胞を染色しました。その後、スフェロイドを洗浄し、Alexa Fluor 647色素を結合させたKi67抗体で染色しました。CellInsight CX7 LZR HCS機器で共焦点を使用して、スフェロイドを10x対物レンズで自動イメージングしました。画像は複数のZ断面の最大強度を投影したものです。スフェロイドを1つの対象物としてセグメンテーションし、EdU陽性細胞およびKi67陽性細胞はスフェロイド内の点として定量しました。コントロールスフェロイドでは、EdU陽性細胞とKi67陽性細胞の両方が観察されました。Hydroxyure処理スフェロイドでは、活発に増殖しているS期細胞が消失し（EdU陰性）、Ki67陽性細胞のみが観察されました。

がん免疫学アプリケーション：T細胞の浸透と肺がんスフェロイド致死のイメージング

T細胞の浸透と肺がんスフェロイド致死。Gibco Minomed Essential Medium（MEM）を使用して、Nunclon Sphera U底プレートにA549細胞を播種して2日間培養し、スフェロイドを形成させました。 Dynabeads Human T-Expander CD3/CD28を使用してヒト（末梢血単核細胞（PBMC）から分離したT細胞 を72時間活性化させ、 CellTracker Deep Red Dyeで標識した後に、肺がんス フェロイドに添加して4時間培養しました。細胞を CellEvent Caspase 3/7 Reagentで標識しました。CellInsight CX7 LZR High-Content Platformで、生細胞全スフェロイドイメージングを使用してT細胞の浸透と腫瘍細胞毒性を評価しました。CellEvent Caspase 3/7 Reagent（緑）による染色の増加に見られるように、活性化T細胞はスフェロイド（赤）を貫通し、スフェロイド全体にわたり標的細胞でアポトーシスを誘導しました。