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蛋白样品制备方法步骤
蛋白制备的目的是获取高品质蛋白样品，以尽可能提高下游分析的成功率（例如蛋白质免疫印迹、ELISA、免疫沉淀和质谱分析）。由于蛋白质的结构和功能各不相同，如何平衡提取效率和下游分析中所需蛋白功能的维持是经常面临的挑战。这种权衡对于生物学现象的研究来说至关重要，而实验的成功取决于蛋白样品制备的所选方法和试剂。
遵循这 5 个步骤，实现高质量的蛋白样品制备
从样品中提取你的靶蛋白
蛋白分析的第一步是蛋白提取，这就需要释放不同来源样品中的蛋白质。无论通过机械处理还是基于去垢剂的提取方法，都会不可避免地破坏细胞稳态，导致蛋白降解或不稳定。因此，提取过程中蛋白的完整性直接决定了下游蛋白样品分析所得数据的质量。例如，某些提取方法可能在细胞裂解和细胞内含物的溶解方面有效，但可能会导致蛋白变性，影响天然蛋白相互作用的检测和分析。
推荐产品
样品类型
培养的哺乳动物细胞，哺乳动物组织和原代细胞是生理相关的内源性蛋白（包括翻译后修饰）研究，以及过表达系统（瞬时或稳态）的常见样品来源。当提取哺乳动物组织中的蛋白质时，需要一些温和的酶或机械破碎手段来帮助从较复杂组织基质中分离细胞。对于仅通过质膜将细胞内容物与环境隔离开的培养哺乳动物细胞和原代细胞来说，试剂中的去垢剂可打破蛋白-脂质膜双层结构，使总蛋白提取更为容易。通常所研究的或用于重组蛋白表达系统的其他生物体包括细菌、酵母和植物。这些细胞类型含有细胞壁，需要额外使用酶解或机械破碎的方法才能有效释放蛋白。然而，目前已开发出基于去垢剂的解决方案，可有效提取和溶解这些细胞中的蛋白，而无需机械外力破坏。该方法对于处理更多样品数量或使用自动提取和纯化方案来说尤其重要。
亚细胞分级分离
对于大多数研究来说，只需直接制备全细胞裂解物以获取可溶蛋白样品，用于下游直接检测或进一步纯化与分离。但是，如果在蛋白提取之前将细胞分为不同的区室或细胞器，可以显著提高特定蛋白的产量或富集率。机械裂解通常会破坏所有细胞区室，使分离特定细胞组分变得更加困难。但是，通过谨慎优化试剂，已开发出基于逐级差异去垢剂的方法来分离核蛋白、胞质蛋白和膜蛋白组分。该方法可以将疏水性膜蛋白溶解，使其与亲水蛋白分离，并且可以分离完整细胞核、线粒体和其他细胞器，用于直接研究或分步提取蛋白。
样品来源或样品类型。收集样品时的常用蛋白来源可能包括哺乳动物细胞培养物、组织或体液等天然来源。此外，蛋白也可能在表达系统（例如酵母、细菌、昆虫或哺乳动物细胞）中过表达。
蛋白制备决策树。该图描述了选择特定蛋白分离方法时涉及的考虑因素。
蛋白样品制备流程。该工作流程首先是进行细胞裂解，样品制备涉及的步骤实现了将含有组分的蛋白从起始生物来源转变为均质溶液，同时保留蛋白的体内状态。获得高品质裂解物对于成功进行下游应用来说至关重要。
| 产品推荐 | 描述 |
|---|---|
| 总蛋白提取试剂（PER） | 专为从各种蛋白样品类型中提取全蛋白而研发的蛋白提取试剂 |
| 分级分离试剂 | 这类试剂设计用于富集或分级分离细胞组分或细胞器，包括细胞核、胞质、线粒体、膜、质膜和细胞外基质 |
| GPCR 提取和稳定试剂 | 可有效溶解和稳定 GPCR 的蛋白提取试剂 |
| Surfact-Amps 去垢剂 | 这种去垢剂溶液尤其适用于对未纯化去垢剂中杂质敏感的应用和检测 |
小贴士
- 细胞裂解时会破坏细胞膜和细胞器，导致蛋白水解活性不受调控，从而降低蛋白产量并影响蛋白功能。为了防止提取的蛋白降解，通常需要在细胞裂解试剂中添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂。
- 通过 SDS-PAGE 分析溶解蛋白和不溶性组分蛋白样品，可测定所用蛋白提取方法的效率。
蛋白提取产品：
防止你的靶蛋白降解
细胞裂解时会破坏细胞膜和细胞器，导致蛋白水解活性不受调控，从而降低蛋白产量并影响蛋白功能。为了防止提取的蛋白降解并保持其活性，通常需要在细胞裂解试剂中添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂。
蛋白酶抑制剂通过与蛋白酶活性位点结合而起作用。由于蛋白水解机制的差异，单一化合物无法有效抑制所有蛋白酶，因此，需要使用几种不同抑制剂的混合物来确保蛋白提取物在下游分析之前不被降解。典型的抑制剂混合物包括丝氨酸、半胱氨酸和天冬氨酸蛋白酶等小分子抑制剂，以及氨基肽酶和金属蛋白酶。尽管有些抑制剂是不可逆的，但很多抑制剂是可逆的，它们需要长时间存在于粗制蛋白样品中，直到后续进行了纯化，免除了蛋白水解活性的风险为止。
同样，磷酸酶也各有不同，因此建议使用有效的磷酸酶混合物（含丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、酸性和碱性磷酸酶的抑制剂）来保持脆弱的磷酸化翻译后修饰。
通过使用正确的保存方法来防止靶蛋白降解：
- 快速操作并保持蛋白样品低温（可使用液氮冷冻蛋白样品）
- 抑制或灭活内源性蛋白酶和磷酸酶
- 添加保护或稳定化合物，例如还原剂和酶抑制剂
- 通过沉淀稳定或灭活蛋白
| 产品推荐 | 描述 |
|---|---|
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | 广谱蛋白酶和磷酸酶抑制浓缩液和片剂。 |
小贴士
- 大多数研究人员会使用几种不同抑制剂的混合物，以确保蛋白提取物在靶标分析之前不被降解。蛋白酶抑制剂基本在所有蛋白提取中都需要使用，而磷酸酶抑制剂仅在研究磷酸化状态时才需要使用。
推荐产品
Pierce™ 蛋白酶抑制剂片剂，无 EDTA
货号：A32965
Pierce 蛋白酶抑制剂片剂通过抑制细胞裂解物样品中通常存在的丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶及氨基肽酶来防止蛋白发生蛋白水解降解。该片剂含有 AEBSF、抑肽酶、苯丁抑制素、E-64、亮肽素和抑胃肽 A。在 4°C 下储存时可保持稳定长达 12 个月，每粒片剂足以处理 50 mL 溶液，它适用于从组织和培养细胞中提取蛋白之前的试剂制备。
蛋白防降解产品：
蛋白样品除杂下载蛋白样品除杂技术手册
蛋白提取后，蛋白样品通常含有影响蛋白稳定性或与下游应用不兼容的杂质。透析、脱盐和浓缩是去除蛋白样品中常见小分子污染物（例如盐和去垢剂）的三种常用方法。根据下游应用要求，选择方法时的考虑因素可能包括蛋白样品起始量、蛋白功能和处理时间。透析、脱盐和浓缩的有多种规格和包装形式。
透析
透析是一种经典分离技术，它通过半透膜选择性扩散，去除蛋白溶液中的小分子和不需要的化合物。将蛋白样品和缓冲液置于膜的相对侧。大于膜孔的蛋白保留在膜的样品侧，较小的分子（污染物）通过膜自由扩散，直至达到平衡浓度。这种技术可以使蛋白样品中小分子污染物的浓度降低至可接受水平。
脱盐
体积排阻色谱法也称凝胶过滤法，可用于去除蛋白样品中的盐分。使用这种技术时，需要选择一种孔足够大的树脂使小分子盐进入，但也要足够小，使靶蛋白不能进入。通过这种方法来减缓杂质的迁移速度，使较大且较快的蛋白在重力流或离心过程中与较慢且较小的分子分离开。
浓缩
蛋白浓缩与透析法类似，其使用半透膜将蛋白与小分子量化合物分离。与透析法的被动扩散原理不同，浓缩是通过离心使溶液穿过膜而实现的。在离心过程中，缓冲液和小分子量溶质均被动穿过膜，并在另一侧收集（滤液）。大分子（蛋白）保留在膜的样品侧，其随着试剂被动穿过膜到达另一侧而浓缩为小体积液体（截留液）。
| 产品推荐 | 类别 | 描述 | 样品体积 |
|---|---|---|---|
| Slide-A-Lyzer 产品 | 透析 | 去除盐或其他小分子污染物 | 10 uL-250 mL |
| Zeba 产品 | 脱盐 | 除盐 | 2 uL-4 mL |
| 染料和生物素去除产品 | 小分子样品处理 | 去除游离/未结合的染料、生物素、交联剂和还原剂 | 40 uL-4mL |
| 浓缩管 | 浓缩 | 浓缩、脱盐、缓冲液置换 | 100 uL-100 mL |
小贴士
- 如果蛋白浓度太低而无法进一步处理或分析，可以使用离心浓缩管快速浓缩蛋白样品。
- 若要在浓缩技术中进行缓冲液置换，可以使用置换缓冲液稀释截留液并离心。此过程可以重复进行，直至达到所需置换或脱盐水平。
推荐产品
Zeba™ 脱盐离心板 (7K MWCO)
货号：89883
Thermo Scientific Zeba 脱盐离心板 (7K MWCO) 包含尺寸排阻色谱树脂，可以离心形式对 2µL 至 4 mL 蛋白样品进行出色的蛋白脱盐，低结合树脂极大提高了蛋白回收率，无需筛选或等待依赖重力流出的蛋白，比其他市售预装柱更经济实用。
Pierce™ 蛋白浓缩管 PES，10K MWCO，5-20 mL
货号：88513
Thermo Scientific™ Pierce™ 蛋白浓缩管 (PES) 为一次性超滤离心管，配有聚醚砜（polyethersulfone，以下简称 PES）膜，用于生物样品的浓缩、脱盐和缓冲液置换。本产品的截留分子量 (MWCO) 为 10K，可处理体积为 5-20 mL 的样品。
蛋白样品除杂产品：
靶蛋白定量
总蛋白浓度测定是通过生化方法分离和分析蛋白的工作流程中的重要步骤。定量方法可以选择使用 荧光计 、 分光光度计或 酶标仪进行 荧光法 或 比色法 检测。根据分析类型和所分析特定蛋白样品的不同，每种蛋白检测方法都存在其局限性。选择蛋白检测方法时需要考虑的重要特性包括灵敏度（检测下限）、与样品中常见物质（例如去垢剂、还原剂、离散剂、抑制剂、盐和缓冲液）的兼容性、标准曲线线性度以及蛋白间差异。
比色法蛋白定量
可使用酶标仪或分光光度计检测比色信号。我们最受欢迎的比色法蛋白定量试剂有：
- BCA 定量：蛋白-铜螯合及还原铜的二次检测
- Bradford 定量：蛋白-染料结合，可直接检测与结合染料相关的颜色变化
荧光法蛋白定量
基于荧光进行蛋白定量是除比色法以外的另一选择。荧光检测法具有出色的灵敏度，所需蛋白样品量少，可节省更多蛋白样品用于其他实验。此外，读取时间并非关键因素，因此这种检测方法可轻松应用于自动化高通量分析。可使用荧光计或酶标仪检测荧光信号。
| 产品推荐 | 类别 | 描述 |
|---|---|---|
| Pierce BCA 蛋白定量试剂盒 | 比色法 | 双组分，是准确度高、兼容去垢剂的蛋白定量方法。与大多数染料结合法相比，BCA 法受蛋白组成差异的影响小得多，浓度测定的准确度更高。 |
| Pierce Rapid Gold BCA 蛋白定量试剂盒 | 比色法 | 该试剂盒延续了经典 BCA 法的关键特点，同时具备与染料结合法相同的快速和室温孵育的优势。 |
| Quant-iT 蛋白检测 | 荧光检测法 | 这一检测方法具有较高的蛋白选择性，蛋白间差异很小。该检测方法在室温下进行，信号可稳定保持 3 小时。 |
| Qubit 4 荧光计 | 荧光计 | Qubit 4 荧光计是备受欢迎的 Qubit 荧光计的最新版本，可精确测量蛋白含量。 |
小贴士
- 没有一种试剂是所有应用的完美或最佳方法。每种方法都有其优势和劣势。
- 可根据蛋白样品类型、检测时间、读数（比色法或荧光法）以及与去垢剂或还原剂的兼容性，通过交互式 蛋白定量方法选择指南 来选择产品。
- 如要了解关于蛋白浓度测定方法的更多信息，请继续阅读这篇文章： 蛋白定量概述。
基于常见裂解缓冲液的推荐定量方法
| 裂解/提取缓冲液 | 推荐蛋白定量方法 | 如果添加了还原剂或金属螯合剂（如 1 mM 以上的 DTT，10 mM 以上的 EDTA） |
|---|---|---|
| RIPA | BCA 蛋白定量 | BCA 蛋白定量—还原剂兼容型 |
| M-PER 哺乳动物蛋白提取试剂 | BCA 蛋白定量 | Coomassie Plus |
| B-PER 细菌蛋白提取试剂 | BCA 蛋白定量 | BCA 蛋白定量—还原剂兼容型 |
| NE-PER 核蛋白和胞浆蛋白提取试剂 | BCA 蛋白定量 | Coomassie Plus |
| 细胞提取缓冲液 | BCA 蛋白定量—还原剂兼容型 |
小贴士
- BCA 蛋白检测相比基于考马斯染料的检测方法（Bradford 检测）具有独特的优势，因为它们可以兼容包含多达 5％ 表面活性剂（去垢剂）的样品，并且受蛋白组成差异的影响小得多，从而提供了更大的蛋白间一致性和定量准确性。
基于所需灵敏度的推荐定量方法
与标准比色方案的 500 ng/mL 和增强型比色方案的 2,000 ng/mL 检测浓度下限相比，荧光检测法可用于定量样品量极少或浓度极低的蛋白样品，灵敏度可达 10 ng/ml。
| 蛋白样品类型要求 | 推荐蛋白定量产品 |
|---|---|
| 浓度极低或体积非常有限的蛋白样品（最低样品量：1 µL） | CBQCA 蛋白定量试剂盒 |
小贴士
- CBQCA 蛋白定量试剂盒是一种非常灵敏的蛋白溶液定量方法，蛋白检测浓度下限可达 10 ng/mL。与我们的 NanoOrange 蛋白定量试剂（N-6666）灵敏度相近，CBQCA 更适用于在脂质、膜组分或去垢剂存在的情况下对蛋白以及脂蛋白和小分子肽段进行准确定量。
推荐设备
总蛋白定量一旦完成，就可以使用紫外可见分光光度计读取基于比色法获得的检测结果，或使用荧光计读取基于荧光法获得的检测结果。
Multiskan Sky 全波长酶标仪
Multiskan Sky 全波长酶标仪 是一种紫外/可见微孔板分光光度计，可轻松胜任几乎所有光度法研究应用，尤其适用于 DNA、RNA 和蛋白分析等。对于需要不同终点、动力学和光谱分析的多用户环境而言，它是一种理想选择。Multiskan Sky 仪器包括三种不同配置。带触屏的型号使用户能够灵活选择独立使用仪器或与 Thermo Scientific SkanIt 电脑软件 配合使用。Multiskan Sky不带触屏的型号仅能通过SkanIt软件操作，用户通过电脑完成所有操作。此外，部分型号还具有比色皿检测功能。
推荐产品
蛋白定量产品：
参考文献
- Bradford M (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.Anal Biochem 72:248–254.
- Gornall AG (1949) Determination of serum proteins by means of the biuret reaction.J Biol Chem 177:751–766.
- Lowry OH et al.(1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent.J Biol Chem 193:265–275.
- Smith PK et al.(1985) Measurement of protein using bicinchoninic acid.Anal Biochem 150:76–85.
- Stoscheck CM (1987) Protein assay sensitive at nanogram levels.Anal Biochem 160:301–305.
检测并分析您的靶蛋白
根据实验需要，可以使用多种方法来检测和分析靶蛋白。以下是用于检测和分析复杂混合物（例如裂解物和血清）中蛋白质的常见技术，以及各种技术的特点和常见要求。
| ELISA | 蛋白质免疫印迹 | 质谱分析 | |
|---|---|---|---|
| 优势 |
|
|
|
| 灵敏度 | <5–10 pg/mL | 从低飞克到高阿克* | 摩尔范围（1018） |
| 裂解液兼容性 |
|
|
|
| 常规所需蛋白量 | 0.1–1 µg/mL | 1–50 µg | <1 µg |
| 所需设备 | 酶标仪 | X 光胶片或 CCD 成像系统 | 质谱仪 |
| *使用高灵敏度 HRP 底物，例如 SuperSignal West Atto 极敏底物 | |||
推荐设备
ELISA 检测和分析
Multiskan Sky 全波长酶标仪
除了进行可靠的 ELISA 测量外，还可使用 Thermo Scientific Multiskan Sky 全波长酶标仪进行紫外可见分光光度法研究，例如 DNA、RNA 和蛋白分析。Multiskan Sky 全波长酶标仪具有更宽的波长范围（200–1000 nm），路径长度校正和快速读取速度。通过配置直观的触摸屏用户界面、机载软件和内置方案，帮助您直接使用仪器快速运行检测。此外，购买任意酶标仪，您都可以获得无许可限制且简单易用的 Thermo Scientific SkanIt 软件，并浏览我们内容丰富的在线实验方案库。
蛋白质免疫印迹数据获取和分析
iBright 智能成像系统
iiBright 1500 成像系统功能强大且易于使用，具有灵敏、简化的智能图像采集功能，用于凝胶和蛋白质免疫印迹的数据获取。iBright FL1500 成像系统能够轻松采集 4 个通道的图像。配置大尺寸触摸屏界面和智能操作软件。
推荐产品
PageRuler™ Plus 预染蛋白分子量标准
货号：26619
Thermo Scientific PageRuler Plus 预染蛋白分子量标准是九种蓝色、橙色和绿色染色蛋白（10 至 250 kDa）的混合物，可用作蛋白电泳 (SDS-PAGE) 和 Western 印迹中的分子量标准品。蛋白分子量标准品以即用型规格提供，用于直接上样至凝胶；使用前无需加热、还原或添加上样缓冲液。
SuperSignal™ West Pico PLUS 化学发光底物
货号：34580
Thermo Scientific SuperSignal West Pico PLUS 化学发光底物是一种增强型化学发光 (ECL) 辣根过氧化物酶 (HRP) 底物，可通过蛋白质免疫印迹分析进行皮克级至高飞克级的蛋白检测。
蛋白检测产品：
| 产品/工作流程亮点 | 类别 | 描述 |
|---|---|---|
| 蛋白预制胶 | 电泳和蛋白质免疫印迹 | 满足多种应用需求的优化蛋白凝胶体系 |
| iWestern 工作流程 | 电泳和蛋白质免疫印迹 | 完整、高效、易用的蛋白质免疫印迹解决方案 |
| 蛋白质谱分析工作流程 | 质谱分析 | 蛋白质组学工作流程所使用的质谱试剂、仪器和软件解决方案，适用于发现和靶向蛋白质组学分析 |
| ELISA 试剂盒 | ELISA | 进行 ELISA 只需 5 个简单的步骤，即可获得一致、准确的结果 |
从样品中提取你的靶蛋白
蛋白分析的第一步是蛋白提取，这就需要释放不同来源样品中的蛋白质。无论通过机械处理还是基于去垢剂的提取方法，都会不可避免地破坏细胞稳态，导致蛋白降解或不稳定。因此，提取过程中蛋白的完整性直接决定了下游蛋白样品分析所得数据的质量。例如，某些提取方法可能在细胞裂解和细胞内含物的溶解方面有效，但可能会导致蛋白变性，影响天然蛋白相互作用的检测和分析。
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样品类型
培养的哺乳动物细胞，哺乳动物组织和原代细胞是生理相关的内源性蛋白（包括翻译后修饰）研究，以及过表达系统（瞬时或稳态）的常见样品来源。当提取哺乳动物组织中的蛋白质时，需要一些温和的酶或机械破碎手段来帮助从较复杂组织基质中分离细胞。对于仅通过质膜将细胞内容物与环境隔离开的培养哺乳动物细胞和原代细胞来说，试剂中的去垢剂可打破蛋白-脂质膜双层结构，使总蛋白提取更为容易。通常所研究的或用于重组蛋白表达系统的其他生物体包括细菌、酵母和植物。这些细胞类型含有细胞壁，需要额外使用酶解或机械破碎的方法才能有效释放蛋白。然而，目前已开发出基于去垢剂的解决方案，可有效提取和溶解这些细胞中的蛋白，而无需机械外力破坏。该方法对于处理更多样品数量或使用自动提取和纯化方案来说尤其重要。
亚细胞分级分离
对于大多数研究来说，只需直接制备全细胞裂解物以获取可溶蛋白样品，用于下游直接检测或进一步纯化与分离。但是，如果在蛋白提取之前将细胞分为不同的区室或细胞器，可以显著提高特定蛋白的产量或富集率。机械裂解通常会破坏所有细胞区室，使分离特定细胞组分变得更加困难。但是，通过谨慎优化试剂，已开发出基于逐级差异去垢剂的方法来分离核蛋白、胞质蛋白和膜蛋白组分。该方法可以将疏水性膜蛋白溶解，使其与亲水蛋白分离，并且可以分离完整细胞核、线粒体和其他细胞器，用于直接研究或分步提取蛋白。
样品来源或样品类型。收集样品时的常用蛋白来源可能包括哺乳动物细胞培养物、组织或体液等天然来源。此外，蛋白也可能在表达系统（例如酵母、细菌、昆虫或哺乳动物细胞）中过表达。
蛋白制备决策树。该图描述了选择特定蛋白分离方法时涉及的考虑因素。
蛋白样品制备流程。该工作流程首先是进行细胞裂解，样品制备涉及的步骤实现了将含有组分的蛋白从起始生物来源转变为均质溶液，同时保留蛋白的体内状态。获得高品质裂解物对于成功进行下游应用来说至关重要。
| 产品推荐 | 描述 |
|---|---|
| 总蛋白提取试剂（PER） | 专为从各种蛋白样品类型中提取全蛋白而研发的蛋白提取试剂 |
| 分级分离试剂 | 这类试剂设计用于富集或分级分离细胞组分或细胞器，包括细胞核、胞质、线粒体、膜、质膜和细胞外基质 |
| GPCR 提取和稳定试剂 | 可有效溶解和稳定 GPCR 的蛋白提取试剂 |
| Surfact-Amps 去垢剂 | 这种去垢剂溶液尤其适用于对未纯化去垢剂中杂质敏感的应用和检测 |
小贴士
- 细胞裂解时会破坏细胞膜和细胞器，导致蛋白水解活性不受调控，从而降低蛋白产量并影响蛋白功能。为了防止提取的蛋白降解，通常需要在细胞裂解试剂中添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂。
- 通过 SDS-PAGE 分析溶解蛋白和不溶性组分蛋白样品，可测定所用蛋白提取方法的效率。
蛋白提取产品：
防止你的靶蛋白降解
细胞裂解时会破坏细胞膜和细胞器，导致蛋白水解活性不受调控，从而降低蛋白产量并影响蛋白功能。为了防止提取的蛋白降解并保持其活性，通常需要在细胞裂解试剂中添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂。
蛋白酶抑制剂通过与蛋白酶活性位点结合而起作用。由于蛋白水解机制的差异，单一化合物无法有效抑制所有蛋白酶，因此，需要使用几种不同抑制剂的混合物来确保蛋白提取物在下游分析之前不被降解。典型的抑制剂混合物包括丝氨酸、半胱氨酸和天冬氨酸蛋白酶等小分子抑制剂，以及氨基肽酶和金属蛋白酶。尽管有些抑制剂是不可逆的，但很多抑制剂是可逆的，它们需要长时间存在于粗制蛋白样品中，直到后续进行了纯化，免除了蛋白水解活性的风险为止。
同样，磷酸酶也各有不同，因此建议使用有效的磷酸酶混合物（含丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、酸性和碱性磷酸酶的抑制剂）来保持脆弱的磷酸化翻译后修饰。
通过使用正确的保存方法来防止靶蛋白降解：
- 快速操作并保持蛋白样品低温（可使用液氮冷冻蛋白样品）
- 抑制或灭活内源性蛋白酶和磷酸酶
- 添加保护或稳定化合物，例如还原剂和酶抑制剂
- 通过沉淀稳定或灭活蛋白
| 产品推荐 | 描述 |
|---|---|
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | 广谱蛋白酶和磷酸酶抑制浓缩液和片剂。 |
小贴士
- 大多数研究人员会使用几种不同抑制剂的混合物，以确保蛋白提取物在靶标分析之前不被降解。蛋白酶抑制剂基本在所有蛋白提取中都需要使用，而磷酸酶抑制剂仅在研究磷酸化状态时才需要使用。
推荐产品
Pierce™ 蛋白酶抑制剂片剂，无 EDTA
货号：A32965
Pierce 蛋白酶抑制剂片剂通过抑制细胞裂解物样品中通常存在的丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶及氨基肽酶来防止蛋白发生蛋白水解降解。该片剂含有 AEBSF、抑肽酶、苯丁抑制素、E-64、亮肽素和抑胃肽 A。在 4°C 下储存时可保持稳定长达 12 个月，每粒片剂足以处理 50 mL 溶液，它适用于从组织和培养细胞中提取蛋白之前的试剂制备。
蛋白防降解产品：
蛋白样品除杂下载蛋白样品除杂技术手册
蛋白提取后，蛋白样品通常含有影响蛋白稳定性或与下游应用不兼容的杂质。透析、脱盐和浓缩是去除蛋白样品中常见小分子污染物（例如盐和去垢剂）的三种常用方法。根据下游应用要求，选择方法时的考虑因素可能包括蛋白样品起始量、蛋白功能和处理时间。透析、脱盐和浓缩的有多种规格和包装形式。
透析
透析是一种经典分离技术，它通过半透膜选择性扩散，去除蛋白溶液中的小分子和不需要的化合物。将蛋白样品和缓冲液置于膜的相对侧。大于膜孔的蛋白保留在膜的样品侧，较小的分子（污染物）通过膜自由扩散，直至达到平衡浓度。这种技术可以使蛋白样品中小分子污染物的浓度降低至可接受水平。
脱盐
体积排阻色谱法也称凝胶过滤法，可用于去除蛋白样品中的盐分。使用这种技术时，需要选择一种孔足够大的树脂使小分子盐进入，但也要足够小，使靶蛋白不能进入。通过这种方法来减缓杂质的迁移速度，使较大且较快的蛋白在重力流或离心过程中与较慢且较小的分子分离开。
浓缩
蛋白浓缩与透析法类似，其使用半透膜将蛋白与小分子量化合物分离。与透析法的被动扩散原理不同，浓缩是通过离心使溶液穿过膜而实现的。在离心过程中，缓冲液和小分子量溶质均被动穿过膜，并在另一侧收集（滤液）。大分子（蛋白）保留在膜的样品侧，其随着试剂被动穿过膜到达另一侧而浓缩为小体积液体（截留液）。
| 产品推荐 | 类别 | 描述 | 样品体积 |
|---|---|---|---|
| Slide-A-Lyzer 产品 | 透析 | 去除盐或其他小分子污染物 | 10 uL-250 mL |
| Zeba 产品 | 脱盐 | 除盐 | 2 uL-4 mL |
| 染料和生物素去除产品 | 小分子样品处理 | 去除游离/未结合的染料、生物素、交联剂和还原剂 | 40 uL-4mL |
| 浓缩管 | 浓缩 | 浓缩、脱盐、缓冲液置换 | 100 uL-100 mL |
小贴士
- 如果蛋白浓度太低而无法进一步处理或分析，可以使用离心浓缩管快速浓缩蛋白样品。
- 若要在浓缩技术中进行缓冲液置换，可以使用置换缓冲液稀释截留液并离心。此过程可以重复进行，直至达到所需置换或脱盐水平。
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Pierce™ 蛋白浓缩管 PES，10K MWCO，5-20 mL
货号：88513
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蛋白样品除杂产品：
靶蛋白定量
总蛋白浓度测定是通过生化方法分离和分析蛋白的工作流程中的重要步骤。定量方法可以选择使用 荧光计 、 分光光度计或 酶标仪进行 荧光法 或 比色法 检测。根据分析类型和所分析特定蛋白样品的不同，每种蛋白检测方法都存在其局限性。选择蛋白检测方法时需要考虑的重要特性包括灵敏度（检测下限）、与样品中常见物质（例如去垢剂、还原剂、离散剂、抑制剂、盐和缓冲液）的兼容性、标准曲线线性度以及蛋白间差异。
比色法蛋白定量
可使用酶标仪或分光光度计检测比色信号。我们最受欢迎的比色法蛋白定量试剂有：
- BCA 定量：蛋白-铜螯合及还原铜的二次检测
- Bradford 定量：蛋白-染料结合，可直接检测与结合染料相关的颜色变化
荧光法蛋白定量
基于荧光进行蛋白定量是除比色法以外的另一选择。荧光检测法具有出色的灵敏度，所需蛋白样品量少，可节省更多蛋白样品用于其他实验。此外，读取时间并非关键因素，因此这种检测方法可轻松应用于自动化高通量分析。可使用荧光计或酶标仪检测荧光信号。
| 产品推荐 | 类别 | 描述 |
|---|---|---|
| Pierce BCA 蛋白定量试剂盒 | 比色法 | 双组分，是准确度高、兼容去垢剂的蛋白定量方法。与大多数染料结合法相比，BCA 法受蛋白组成差异的影响小得多，浓度测定的准确度更高。 |
| Pierce Rapid Gold BCA 蛋白定量试剂盒 | 比色法 | 该试剂盒延续了经典 BCA 法的关键特点，同时具备与染料结合法相同的快速和室温孵育的优势。 |
| Quant-iT 蛋白检测 | 荧光检测法 | 这一检测方法具有较高的蛋白选择性，蛋白间差异很小。该检测方法在室温下进行，信号可稳定保持 3 小时。 |
| Qubit 4 荧光计 | 荧光计 | Qubit 4 荧光计是备受欢迎的 Qubit 荧光计的最新版本，可精确测量蛋白含量。 |
小贴士
- 没有一种试剂是所有应用的完美或最佳方法。每种方法都有其优势和劣势。
- 可根据蛋白样品类型、检测时间、读数（比色法或荧光法）以及与去垢剂或还原剂的兼容性，通过交互式 蛋白定量方法选择指南 来选择产品。
- 如要了解关于蛋白浓度测定方法的更多信息，请继续阅读这篇文章： 蛋白定量概述。
基于常见裂解缓冲液的推荐定量方法
| 裂解/提取缓冲液 | 推荐蛋白定量方法 | 如果添加了还原剂或金属螯合剂（如 1 mM 以上的 DTT，10 mM 以上的 EDTA） |
|---|---|---|
| RIPA | BCA 蛋白定量 | BCA 蛋白定量—还原剂兼容型 |
| M-PER 哺乳动物蛋白提取试剂 | BCA 蛋白定量 | Coomassie Plus |
| B-PER 细菌蛋白提取试剂 | BCA 蛋白定量 | BCA 蛋白定量—还原剂兼容型 |
| NE-PER 核蛋白和胞浆蛋白提取试剂 | BCA 蛋白定量 | Coomassie Plus |
| 细胞提取缓冲液 | BCA 蛋白定量—还原剂兼容型 |
小贴士
- BCA 蛋白检测相比基于考马斯染料的检测方法（Bradford 检测）具有独特的优势，因为它们可以兼容包含多达 5％ 表面活性剂（去垢剂）的样品，并且受蛋白组成差异的影响小得多，从而提供了更大的蛋白间一致性和定量准确性。
基于所需灵敏度的推荐定量方法
与标准比色方案的 500 ng/mL 和增强型比色方案的 2,000 ng/mL 检测浓度下限相比，荧光检测法可用于定量样品量极少或浓度极低的蛋白样品，灵敏度可达 10 ng/ml。
| 蛋白样品类型要求 | 推荐蛋白定量产品 |
|---|---|
| 浓度极低或体积非常有限的蛋白样品（最低样品量：1 µL） | CBQCA 蛋白定量试剂盒 |
小贴士
- CBQCA 蛋白定量试剂盒是一种非常灵敏的蛋白溶液定量方法，蛋白检测浓度下限可达 10 ng/mL。与我们的 NanoOrange 蛋白定量试剂（N-6666）灵敏度相近，CBQCA 更适用于在脂质、膜组分或去垢剂存在的情况下对蛋白以及脂蛋白和小分子肽段进行准确定量。
推荐设备
总蛋白定量一旦完成，就可以使用紫外可见分光光度计读取基于比色法获得的检测结果，或使用荧光计读取基于荧光法获得的检测结果。
Multiskan Sky 全波长酶标仪
Multiskan Sky 全波长酶标仪 是一种紫外/可见微孔板分光光度计，可轻松胜任几乎所有光度法研究应用，尤其适用于 DNA、RNA 和蛋白分析等。对于需要不同终点、动力学和光谱分析的多用户环境而言，它是一种理想选择。Multiskan Sky 仪器包括三种不同配置。带触屏的型号使用户能够灵活选择独立使用仪器或与 Thermo Scientific SkanIt 电脑软件 配合使用。Multiskan Sky不带触屏的型号仅能通过SkanIt软件操作，用户通过电脑完成所有操作。此外，部分型号还具有比色皿检测功能。
推荐产品
蛋白定量产品：
参考文献
- Bradford M (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.Anal Biochem 72:248–254.
- Gornall AG (1949) Determination of serum proteins by means of the biuret reaction.J Biol Chem 177:751–766.
- Lowry OH et al.(1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent.J Biol Chem 193:265–275.
- Smith PK et al.(1985) Measurement of protein using bicinchoninic acid.Anal Biochem 150:76–85.
- Stoscheck CM (1987) Protein assay sensitive at nanogram levels.Anal Biochem 160:301–305.
检测并分析您的靶蛋白
根据实验需要，可以使用多种方法来检测和分析靶蛋白。以下是用于检测和分析复杂混合物（例如裂解物和血清）中蛋白质的常见技术，以及各种技术的特点和常见要求。
| ELISA | 蛋白质免疫印迹 | 质谱分析 | |
|---|---|---|---|
| 优势 |
|
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|
| 灵敏度 | <5–10 pg/mL | 从低飞克到高阿克* | 摩尔范围（1018） |
| 裂解液兼容性 |
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| 常规所需蛋白量 | 0.1–1 µg/mL | 1–50 µg | <1 µg |
| 所需设备 | 酶标仪 | X 光胶片或 CCD 成像系统 | 质谱仪 |
| *使用高灵敏度 HRP 底物，例如 SuperSignal West Atto 极敏底物 | |||
推荐设备
ELISA 检测和分析
Multiskan Sky 全波长酶标仪
除了进行可靠的 ELISA 测量外，还可使用 Thermo Scientific Multiskan Sky 全波长酶标仪进行紫外可见分光光度法研究，例如 DNA、RNA 和蛋白分析。Multiskan Sky 全波长酶标仪具有更宽的波长范围（200–1000 nm），路径长度校正和快速读取速度。通过配置直观的触摸屏用户界面、机载软件和内置方案，帮助您直接使用仪器快速运行检测。此外，购买任意酶标仪，您都可以获得无许可限制且简单易用的 Thermo Scientific SkanIt 软件，并浏览我们内容丰富的在线实验方案库。
蛋白质免疫印迹数据获取和分析
iBright 智能成像系统
iiBright 1500 成像系统功能强大且易于使用，具有灵敏、简化的智能图像采集功能，用于凝胶和蛋白质免疫印迹的数据获取。iBright FL1500 成像系统能够轻松采集 4 个通道的图像。配置大尺寸触摸屏界面和智能操作软件。
推荐产品
PageRuler™ Plus 预染蛋白分子量标准
货号：26619
Thermo Scientific PageRuler Plus 预染蛋白分子量标准是九种蓝色、橙色和绿色染色蛋白（10 至 250 kDa）的混合物，可用作蛋白电泳 (SDS-PAGE) 和 Western 印迹中的分子量标准品。蛋白分子量标准品以即用型规格提供，用于直接上样至凝胶；使用前无需加热、还原或添加上样缓冲液。
SuperSignal™ West Pico PLUS 化学发光底物
货号：34580
Thermo Scientific SuperSignal West Pico PLUS 化学发光底物是一种增强型化学发光 (ECL) 辣根过氧化物酶 (HRP) 底物，可通过蛋白质免疫印迹分析进行皮克级至高飞克级的蛋白检测。
蛋白检测产品：
| 产品/工作流程亮点 | 类别 | 描述 |
|---|---|---|
| 蛋白预制胶 | 电泳和蛋白质免疫印迹 | 满足多种应用需求的优化蛋白凝胶体系 |
| iWestern 工作流程 | 电泳和蛋白质免疫印迹 | 完整、高效、易用的蛋白质免疫印迹解决方案 |
| 蛋白质谱分析工作流程 | 质谱分析 | 蛋白质组学工作流程所使用的质谱试剂、仪器和软件解决方案，适用于发现和靶向蛋白质组学分析 |
| ELISA 试剂盒 | ELISA | 进行 ELISA 只需 5 个简单的步骤，即可获得一致、准确的结果 |
相关资源
5步法高质量蛋白样品制备步骤
仅供科研使用，不可用于诊断目的。