TALENおよびCRISPRのバリデーションツール

ゲノム編集実験の最適化と検証のためのCRISPRバリデーション方法

強力なゲノム編集システムによって、細胞や組織内あるいはin vivoにて特定の遺伝子を改変して治療に役立てるという可能性は、ゲノム編集の研究を行なう業界の原動力となっています。

TALENまたはCRISPR実験のいずれを実行する場合でも、すべてのゲノム編集戦略には、期待されるゲノム編集結果の精度と信頼性の評価や、非特異的なDNA編集のリスクを低減するためのバリデーション計画が必要です。TALENおよびCRISPRのバリデーションは、細胞健全性の評価からターゲット発現にまで、ゲノム編集ワークフローのさまざまなステップで実施する必要があります。

ワークフローの各ステップを選択して、推奨されるバリデーション技術をご覧ください。

GeneArt Genomic Cleavage Detection (GCD) Kitは、CRISPRまたはTALENの挿入、欠失、遺伝子調節を迅速かつ確実に確認できるように設計されたT7エンドヌクレアーゼ アッセイです。細胞の採取から結果の定量化まで、最小限の作業時間により、ゲノム編集結果の解析をわずか4時間で行うことができます。

適切なポジティブ、ネガティブ、および導入コントロールを用いることは、あらゆるゲノム編集バリデーション戦略の成功につながります。遺伝子編集の初期設計から作業結果すべての検証にいたる実験計画を設計する際には、サーモフィッシャーサイエンティフィックから提供されているCRISPRコントロールの包括的な製品シリーズの利用をご検討ください。

TALENおよびCRISPRのバリデーション用コントロールの詳細を見る

GeneArt Genomic Cleavage Detection (GCD) assaysは迅速かつ安価な手法ですが、目的の変異のみが導入されたことを確認するため、結果をさらに分析する必要があります。これは、DNAシーケンスで行うことができます。

サンガーシーケンスは、ターゲットシーケンスにかかるコストが低く、ワークフローがシンプルで、データ解析が複雑でないため、TALENおよびCRISPR実験にとって重要な検証ツールです。 

TALENおよびCRISPRバリデーションのためのサンガーシーケンスの詳細を見る

サンガーシーケンスは、ヌクレアーゼ切断の効率を測定するために使用できます。以下の実験では、処理した細胞のライセートをSeqScanner 2 softwareを使用してシーケンスしました。その結果、編集が行われた配列が混在していることがわかりました（図2A）。次に、Tracking of Indels by Decomposition（TIDE, Brinkman, EK et al.(2014)）ソフトウェアを使用して、結果を解析しました。サーモフィッシャーConnectのSeqScreener Gene Edit Confirmation Appを使用することで、標的変異のスペクトルと頻度を決定することができます。

NGSは、TALENおよびCRISPR解析において、ハイスループット機能を備えた強力なツールとなります。この方法では、TALENおよびCRISPRのすべての標的変異について、定性的および定量的スクリーニングが行えます。NGS は1度に多くのサンプルを分析して、どの細胞が目的のTALENまたはCRISPR標的変異を持っているかを正確に判断できます。また複数サンプルに対するTALENおよびCRISPRのNGS分析によって、オフターゲット効果を評価することも可能です。

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それぞれのCRISPR実験に最適なシーケンス方法を確認するビデオを見る

ゲノム編集のワークフローでは、そのすべてのステップにおいて生存可能で健全な細胞を維持する必要があります。生存率、アポトーシス、ストレス応答のテストはルーチンプロセスとして行う必要があり、効果的な遺伝子改変を検証するだけでなく、最適な実験条件を決定する上でも必要なステップです。

蛍光色素の発現と抗生物質耐性は、トランスフェクションの効率と標的発現を測定するために広く用いられている技術です。

免疫細胞化学は、細胞内の特定のタンパク質を同定する標準的な技術です。抗Cas9一次抗体と標識二次抗体を用いて、蛍光イメージングにより細胞レベルでCas9発現を検出できます。

抗生物質選択、遺伝子発現、免疫細胞化学アッセイは、細胞のゲノム編集に必要なCRISPRコンポーネントの集合体をモニターするためによく利用されています。蛍光タンパク質の発現は直接測定でき、トランスフェクションされた細胞の特定に抗生物質選択を用いる場合は、生存率アッセイを使用して選択プロセスをモニターすることができます。

ウェスタンブロッティングは、分析対象のサンプルに特定のタンパク質が存在するかどうかを検出および決定するために広く使用されている技術です。CRISPR実験では、ウェスタンブロッティングはトランスフェクション効率の判定に使用されており、また発現の測定にも利用されています。

図7では、ウェスタンブロッティングを用いて、異なるCRISPRフォーマットでトランスフェクションした細胞におけるCas9発現を比較しました。また、図8に示すように、ウェスタンブロッティングを使用して、細胞集団での表現型の変化を定量化することもできます。

ターゲット領域のPCR増幅は、ゲル電気泳動、制限酵素処理、サンガーシーケンス、またはTALENおよびCRISPR検証のためのNGSと組み合わせて使用できます。またリアルタイムPCRを利用することで、細胞内の遺伝子発現レベルの検証が行えます。

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ハイコンテントイメージングプラットフォームは、シングルセル解析能力と極めて高速なデータ取得時間により、卓越したハイコンテントスクリーニング（HCS）を提供します。これらの自動顕微鏡蛍光イメージングおよび分析プラットフォームは、タンパク質発現、コンパートメント化、細胞形態学的な変化を、すべて定量的に厳密に検出できます。HCSでは、単層やスフェロイドから取得したインタクトな細胞、固定細胞、または生細胞の野生表現型をバイアスなく決定できます。

細胞のシグナル伝達経路を変化させると、さまざまな範囲に影響が現れるリスクがあります。ターゲットのタンパク質を追跡し、細胞の健全性と挙動の他の側面への影響をモニターすることが重要です。ハイコンテントスクリーニング（HCS）は、この種のマルチパラメーター分析に特に適しており、Invitrogen試薬は細胞の健全性と挙動を調べるための幅広いツールを提供しています。

TALENのカスタムデザインとバリデーションの詳細については、TALEN Design to Validation Services をご覧ください。