- 以实时荧光定量 PCR 几分之一的成本在较短时间内评估 GAPDH siRNA 递送
- 同时分析一份到 96 份样本
- 测量 GAPDH siRNA 诱导的敲低及转染诱导的毒性
- 与 Silencer GAPDH siRNA 对照和 Silencer CellReady 转染优化试剂盒配合使用,以获得完整的转染优化解决方案
高效且可重现的转染对于任何 siRNA 实验都至关重要。 应优化转染条件,以提供最高水平的基因沉默,同时尽可能降低与转染过程相关的毒性。Ambion 的 Silencer GAPDH siRNA 是用于转染优化研究的理想阳性对照,因为其能在人、小鼠和大鼠细胞中有效地沉默 GAPDH(一种广泛且高度表达的基因)。现在,Ambion 开发了一种新的检测试剂盒来快速测量该对照的递送效率和 GAPDH 敲低的诱导水平:KDalert GAPDH 检测试剂盒。
许多研究人员目前正在使用定量 RT-PCR 或 Western 印迹分析评估 siRNA 诱导的敲低效果。这些技术虽然准确,但可能非常耗时耗力。监测 siRNA递送情况的另一种方法是使用荧光标记的 siRNA。该方法的优点是速度较快,但可能不太可靠,因为 siRNA 可能会被捕获在内体或其他亚细胞区室中,导致其无法引导靶标 mRNA 切割。
一种可获取两种关键读数的简单检测试剂盒
新款 KDalert GAPDH 检测试剂盒依赖于基于荧光的简单测定方法,可快速准确地测量细胞裂解物中的 GAPDH 酶活性。通过比较使用 GAPDH siRNA 转染的 GAPDH 酶活性与使用阴性对照 siRNA 转染的 GAPDH 酶活性,即可轻松确定基因沉默水平,进而确定转染是否成功。此外,可使用 KDalert GAPDH 检测试剂盒评估转染条件的细胞毒性。进行此类分析时,使用阴性对照 siRNA
(例如,
Silencer 阴性对照 #1)转染细胞,然后评估相对于未转染细胞的 GAPDH 活性;GAPDH 活性降低提示转染可诱导细胞毒性。由于该检测试剂盒可用于评估 GAPDH siRNA 诱导的敲低和转染诱导的毒性,因此研究人员可将该检测试剂盒与 Silencer GAPDH 和阴性 siRNA 对照结合使用,从而快速确定可在不影响细胞活力的情况下实现有效转染效果的极佳转染条件(图 1)。
图 1.GAPDH 酶活性和 qRT-PCR 数据比较。使用 Silencer GAPDH siRNA 和
Silencer 阴性对照 #1 siRNA 转染不同细胞数量的三种细胞系 (A549, HeLa, SK-N-AS)。在转染后 48 小时,使用 KDalert™ GAPDH 检测试剂盒和 GAPDH mRNA 通过 qRT-PCR 测量 GAPDH 酶活性。对于每种条件,GAPDH siRNA 转染培养物的剩余表达计算为阴性对照 siRNA 转染培养物表达的百分比。
一种可获取两种关键读数的简单检测试剂盒
KDalert GAPDH 检测试剂盒程序既简单又快速。使用时,在转染后 2 至 3 天,将所含的细胞裂解缓冲液加入细胞中,孵育 20 分钟,加入检测试剂的稀释预混液,然后在 4 分钟后使用微孔板或标准荧光计读取荧光的增幅(图 2)。整个程序可以在约 30 分钟内完成,仅需极少的样本处理步骤。
图 2.KDalert™ GAPDH 检测试剂盒方案示意图。
在宽动态范围内兼容多种细胞类型
KDalert GAPDH 检测试剂盒包括足够进行 375 次检测的试剂(300 次检测 + 3 条标准曲线)。该试剂盒可在多种细胞培养条件下用于多种细胞类型。该检测试剂盒的荧光测定性质使其具有高灵敏度和宽动态范围,从而可使用标准方案准确测定由在 96 孔板中铺板的 2,000-12,000 个细胞组成的样本中的 GAPDH 活性,并且借助稍加改进的测定程序测定仅需 500 个细胞/孔或 > 12,000 个 GAPDH 细胞/孔即可完成测定。
Ambion 的用于 siRNA 转染和转染优化的完整解决方案的一部分
KDalert GAPDH 检测试剂盒可与用于 siRNA 转染和转染优化的其他 Ambion 产品无缝集成,这些产品包括:
Silencer GAPDH 和阴性对照 siRNA、
Silencer CellReady 转染优化试剂盒、
siPORT NeoFX 转染试剂和
Silencer siRNA 转染 II 试剂盒。
科学参与人员Luis Foncerrada、Mike Byrom、Leslie Beauchamp、Lance Ford、
Joe Krebs • Ambion, Inc.
AM1639,AM4605,AM4611,AM4613,AM4624,13778075,13778150