RNAi 概述和典型 RNAi 实验的要求

在非哺乳动物系统中引入或表达长双链 RNA (dsRNA) 会触发 RNAi 通路。细胞质核酸酶 Dicer 首先将长 dsRNA 切割为 21 - 23 bp 的小干扰 RNA (siRNA)，然后 siRNA 解旋并被组装成 RNA 诱导沉默复合物 (RISC)（图 1）。然后，反义 siRNA 链将 RISC 引导至互补 RNA 分子中，RISC 则会切割 mRNA，最终导致特异性基因沉默。然而，由于大多数哺乳动物细胞在引入超过 30 bp 的 dsRNA 时会显示出强效抗病毒反应，因此研究人员使用 21 - 23 bp 的 siRNA 来转染细胞，以便在不引起抗病毒反应的情况下在这些系统中诱导 RNAi。

诱导和分析 RNAi 效应所需的试剂非常简单：

• 靶向特定基因转录本以诱导 RNAi 通路的特异性 dsRNA
• 高效的 dsRNA 递送系统
• RNAi 效应检测
• 适当的对照

在非哺乳动物系统（如秀丽隐杆线虫和果蝇）中，使用与靶转录本互补的长 dsRNA（通常 > 200 bp）诱导 RNAi。通过体外转录可轻松生成 dsRNA。MEGAscript RNAi 试剂盒专门为此而开发。用于在许多非哺乳动物系统中诱导 RNAi 的 dsRNA 设计非常简单，几乎所有与靶转录本互补的长 dsRNA 都可以实现此目的。递送方法通常也很简单。例如，要将 dsRNA 递送至果蝇 S2 细胞，可将 dsRNA 直接添加到培养基中。也可将 dsRNA 直接注入蠕虫或果蝇胚胎中。大多数研究人员使用之前已证明具有易于测量的生物效应的长 dsRNA 作为阳性对照，使用不靶向该生物体中任何转录本的 dsRNA（例如，靶向荧光素酶的 dsRNA）作为阴性对照。

在培养的哺乳动物细胞中，RNAi 通常在细胞内的 DNA 构建体中由直接引入或表达为发夹结构的 siRNA 诱导产生。目前，有六种生成 siRNA 的方法：

体外制备 siRNA

• 化学合成
• 体外转录
• 通过 RNase III 或 Dicer 在体外对长 dsRNA 进行酶切

引入在细胞内表达 siRNA 的基于 DNA 的载体和盒

• 通过质粒表达
• 通过病毒载体表达
• 通过 PCR 产物表达

实施所有这些方法（通过对长 dsRNA 进行酶切来创建 siRNA 群体除外）时，都需要仔细设计 siRNA，以尽可能提高靶基因沉默，同时尽可能降低对脱靶基因的影响。Ambion 通过高质量试剂盒和试剂为所有 6 种 siRNA 合成方法提供支持。

目前，较广泛的 RNAi 应用涉及对培养的哺乳动物细胞进行瞬时转染，然后进行下游检测以监测 RNAi 效应。对于这种应用，化学合成是首选且应用较广泛的 siRNA 制备方法。siRNA 比质粒更容易转染。更重要的是，有即用型形式的预设计基因特异性 siRNA 可供选择，这一点使得该方法极为简单且极有可能获得成功。

Ambion 与 Cenix BioScience 合作，提供了针对 > 34,000 个人、小鼠和大鼠靶标（> RefSeq 数据库中所有人、小鼠和大鼠基因的 98%）的经专家设计且能够确保用户获得沉默效果的 siRNA。这些 siRNA 可作为 Silencer™ 预设计或经验证的 siRNA 单独提供，也可作为 Silencer™ siRNA 文库在专注于功能类别的 siRNA 集中提供。通过单独 siRNA 能够详细分析单个基因在一个或多个通路中的作用，而通过 siRNA 集（文库）能够实现大规模筛选实验并将基因与细胞功能联系起来。

一旦获得 siRNA，您就需要一种将其递送至细胞中的方法。对于许多无限增殖化细胞系，使用基于脂质体或胺的试剂进行转染是首选选项。Ambion 的 siPORT™ 脂质体和 siPORT™ 胺转染试剂专为此目而设计。然而，使用标准转染方法将细胞递送至原代细胞和悬浮细胞中可能存在问题（即使并非不可能）。在这些情况下，使用一种专用的对细胞温和的缓冲液和优化的脉冲条件进行电穿孔通常可在不影响细胞活力的情况下高效递送 siRNA。Ambion 的 siPORT™ siRNA 电穿孔缓冲液是一种革命性的新型缓冲液，使电穿孔成为将 siRNA 递送至原代和其他难转染细胞类型中的理想方法。

每项 RNAi 实验都需要使用合适的对照。需要使用不靶向任何内源性转录本的阴性对照，以控制因引入任何 siRNA 而对基因表达产生的非特异性效应。对于绝大多数实验，Ambion 科学家使用并推荐 Silencer™ 阴性对照 #1 siRNA。这种阴性对照已经过广泛测试，并证明其在人、小鼠和大鼠细胞中几乎没有非特异性效应。需要使用易于检测的阳性对照，以优化转染条件，确保 siRNA 被高效递送，并确定特定下游检测有效。由于阳性对照用于 RNAi 实验的许多不同方面，因此通常需要一种以上对照。对于转染优化实验， Silencer™ GAPDH siRNA 是一种理想的阳性对照。该 siRNA 可有效地实现 GAPDH 表达沉默，且其效应可通过 qRT-PCR 或其他方法在 mRNA 水平上轻松监测，或者通过 Western 印迹或免疫荧光在蛋白水平上轻松监测。事实上，Ambion 提供了用于测量这些蛋白水平效应的高特异性抗体。

有几种用于测量 RNAi 效应的检测产品。要了解敲低靶基因的生物效应，可使用基于细胞的检测、酶法测定、阵列分析以及多种其他工具。但在进行这些检测之前，需要确认 siRNA 诱导的是其预期靶标的敲低。siRNA 在 mRNA 水平上发挥其效应。因此，用于 siRNA 验证和转染优化的首选检测方法是监测靶标 mRNA 水平的方法。用于 siRNA 验证和转染优化的非常简单且可以说是非常好的检测方法借助 qRT-PCR 来测量经基因特异性 siRNA 处理的细胞与经阴性对照 siRNA 处理的细胞中的靶标转录本水平。Applied Biosystems 的 TaqMan 基因表达检测试剂盒可用于 > 41,000 个人、小鼠和大鼠基因，是此类应用的理想选择。Ambion 的 siRNA 数据库提供了转至与基因特异性 Silencer™ 预设计和经验证的 siRNA 匹配的单个检测产品的链接，使您能够非常快速且轻松地找到适用于您的感兴趣基因的 siRNA 和实时荧光定量 PCR 检测试剂盒。 使用 Cells-to-Signal™ 试剂盒可节省更多时间。通常在 qRT-PCR 之前进行 RNA 分离。通过 Cells-to-Signal 试剂盒，您可直接在裂解物中进行 qRT-PCR，无需分离 RNA。Cells-to-Signal 程序可与 TaqMan 基因表达检测试剂盒兼容。

尽管有必要监测 mRNA 水平以验证 siRNA，但大多数研究人员也想确定蛋白水平的敲低程度。Ambion 的 PARIS™ 试剂盒（蛋白和 RNA 分离系统）提供了一种从同一样本中分离总 RNA 和蛋白的简单方法。使用该试剂盒分离的 RNA 可用于 RT-PCR、阵列分析、Northern 印迹或其他分析技术，且蛋白裂解液可与 Western 印迹兼容。由于在大多数情况下能够回收天然蛋白，因此也可以进行酶法测定。

谨慎的研究人员会将 siRNA、靶标 mRNA 和靶蛋白水平关联起来。然而，分离和检测小 RNA 需要使用经过改良且在某些情况下与长 RNA 所需的技术完全不同的技术。新款 mirVana™ PARIS™ 试剂盒不仅与 PARIS 试剂盒一样可以从同一样本中分离 RNA 和蛋白，还可以分离小 RNA 物质（包括 siRNA）。 mirVana™ miRNA 检测试剂盒提供了一种定量测定细胞群中 siRNA 水平的方法，并且该方法也可用于检测靶标 mRNA 水平。

有几种用于测量 RNAi 效应的检测产品。要了解敲低靶基因的生物效应，可使用基于细胞的检测、酶法测定、阵列分析以及多种其他工具。但在进行这些检测之前，需要确认 siRNA 诱导的是其预期靶标的敲低。siRNA 在 mRNA 水平上发挥其效应。因此，用于 siRNA 验证和转染优化的首选检测方法是监测靶标 mRNA 水平的方法。用于 siRNA 验证和转染优化的非常简单且可以说是非常好的检测方法借助 qRT-PCR 来测量经基因特异性 siRNA 处理的细胞与经阴性对照 siRNA 处理的细胞中的靶标转录本水平。Applied Biosystems 的 TaqMan 基因表达检测试剂盒可用于 > 41,000 个人、小鼠和大鼠基因，是此类应用的理想选择。Ambion 的 siRNA 数据库提供了转至与基因特异性 Silencer™ 预设计和经验证的 siRNA 匹配的单个检测产品的链接，使您能够非常快速且轻松地找到适用于您的感兴趣基因的 siRNA 和实时荧光定量 PCR 检测试剂盒。 使用 Cells-to-Signal™ 试剂盒可节省更多时间。通常在 qRT-PCR 之前进行 RNA 分离。通过 Cells-to-Signal 试剂盒，您可直接在裂解物中进行 qRT-PCR，无需分离 RNA。Cells-to-Signal 程序可与 TaqMan 基因表达检测试剂盒兼容。

尽管有必要监测 mRNA 水平以验证 siRNA，但大多数研究人员也想确定蛋白水平的敲低程度。Ambion 的 PARIS™ 试剂盒（蛋白和 RNA 分离系统）提供了一种从同一样本中分离总 RNA 和蛋白的简单方法。使用该试剂盒分离的 RNA 可用于 RT-PCR、阵列分析、Northern 印迹或其他分析技术，且蛋白裂解液可与 Western 印迹兼容。由于在大多数情况下能够回收天然蛋白，因此也可以进行酶法测定。

谨慎的研究人员会将 siRNA、靶标 mRNA 和靶蛋白水平关联起来。然而，分离和检测小 RNA 需要使用经过改良且在某些情况下与长 RNA 所需的技术完全不同的技术。新款 mirVana™ PARIS™ 试剂盒不仅与 PARIS 试剂盒一样可以从同一样本中分离 RNA 和蛋白，还可以分离小 RNA 物质（包括 siRNA）。 mirVana™ miRNA 检测试剂盒提供了一种定量测定细胞群中 siRNA 水平的方法，并且该方法也可用于检测靶标 mRNA 水平。

因此，要在哺乳动物细胞系统中进行 RNAi 实验，您需要一种能够有效靶向感兴趣基因的基因特异性 siRNA、一种 siRNA 递送方法、一种检测 RNAi 效应的检测方法以及适当的对照。Ambion 可为该流程的每一步提供高质量的试剂和方案，因此您可以花更少的时间在开发和验证试剂和方案上，从而可花更多的时间来解答特定的感兴趣生物学问题。