此外,Silencer Select siRNA 的设计采用化学修饰形式,可提高特异性敲低和减少脱靶效应。综上所述,采用更低浓度的 siRNA 可达到极大的敲低效果。
新型算法
Applied Biosystems 基于支持向量机 (SVM) 人工智能平台开发了一种新型 siRNA 预测算法。相较于通过先前算法预测的 siRNA,使用这种新算法设计并通过新型化学修饰合成(以增强其特异性)的 siRNA 显示出更高的总体效力。这些高效 siRNA 能以低至老一代 siRNA 的 1/10 的浓度实现高效靶标敲低。
使用更少的 siRNA 实现强效敲低
在可通过传统脂质体转染策略轻松转染的细胞中,大部分
Silencer Select siRNA 能够以 ≤ 5 nM 的浓度诱导 ≥ 70% 的敲低。图 1 显示了使用三种
Silencer Select siRNA 敲低编码网格蛋白重链 (CLTC) 的 mRNA 的情况,这些 siRNA 使用新的 SVM 衍生算法设计而成,并通过特异性增强的化学修饰进行合成。这些 Silencer Select siRNA 在高 (100 nM) 和低 (3 nM) siRNA 浓度下均显示出 > 80% 的 CLTC 敲低。这些结果表明,Silencer Select siRNA 具有出色的效力。
图 1.靶向 CLTC 基因的 Ambion Silencer Select siRNA 的效力。使用 1.5 μL siPORT™ NeoFX™ 转染试剂在 24 孔板中以 5 种不同浓度一式三份将靶向人 CLTC 的三种 Silencer Select siRNA 反向转染至 HeLa 细胞中。转染后 24 小时,使用 MagMAX™-96 总 RNA 分离试剂盒从细胞中分离 RNA。使用 Applied Biosystems 高容量 cDNA 逆转录试剂盒合成 cDNA,并在使用 CLTC Hs00191535_m1 TaqMan 基因表达检测试剂盒引物的 RT-PCR 反应中用于扩增 CLTC mRNA。剩余基因表达百分比表示为用靶向 CLTC 的 siRNA 转染的培养物中的 CLTC mRNA 含量相对于用非靶向对照 siRNA 转染的细胞中的 CLTC mRNA 含量。利用针对 18S rRNA 的 TaqMan 基因表达检测试剂盒对总 RNA 浓度的差异进行归一化。
siRNA 效力更高意味着 siRNA 特异性更高
为考察在较低浓度下使用效力更高的 siRNA 对 siRNA 特异性的影响,我们利用 Affymetrix U133 2.0 plus 阵列进行全局基因表达谱分析检测,阵列中含有 47,000 多种人转录本的探针。使用一式三份 HeLa 细胞样本进行阵列分析,样本经 30 nM 或 3 nM 靶向 CLTC 的
Silencer Select siRNA 转染 24 小时。对照组包括使用 30 nM 非靶向阴性对照 siRNA 进行的转染。然后进行统计分析,以确定显示表达变化大于 2 倍且 P 值 < 0.001 的基因的数量("差异表达基因",DEG;图 2)。
图 1.靶向 CLTC 基因的 Ambion Silencer Select siRNA 的效力。使用 1.5 μL siPORT™ NeoFX™ 转染试剂在 24 孔板中以 5 种不同浓度一式三份将靶向人 CLTC 的三种
Silencer Select siRNA 反向转染至 HeLa 细胞中。转染后 24 小时,使用 MagMAX™-96 总 RNA 分离试剂盒从细胞中分离 RNA。使用 Applied Biosystems 高容量 cDNA 逆转录试剂盒合成 cDNA,并在使用 CLTC Hs00191535_m1 TaqMan 基因表达检测试剂盒引物的 RT-PCR 反应中用于扩增 CLTC mRNA。剩余基因表达百分比表示为用靶向 CLTC 的 siRNA 转染的培养物中的 CLTC mRNA 含量相对于用非靶向对照 siRNA 转染的细胞中的 CLTC mRNA 含量。利用针对 18S rRNA 的 TaqMan 基因表达检测试剂盒对总 RNA 浓度的差异进行归一化。
阵列数据以图 3 所示的分层聚类热图表示。这些数据代表差异表达基因及其相较于阴性对照 siRNA 处理样本的变化程度。在 30 nM siRNA 浓度下,使用所有三种 siRNA 进行转染均使靶基因 CLTC 的表达降低至低于阴性对照 siRNA 转染样本的 1/8。以 30 nM 转染
Silencer Select siRNA s475 和 s476 导致 2 种基因的差异表达,其中一种是靶 CLTC(图 3,顶部基因)。siRNA s477 的转染产生 25 种 DEG;其中包括使用 siRNA s475 和 s476 转染后发现的 2 种 DEG(图 2 和 3)。这些结果表明,使用这些 siRNA 可实现极小的脱靶效应和极高的靶标敲低精度。
图 3.分层聚类热图显示 Ambion Silencer Select siRNA 的脱靶效应较低。Partek 的基因组套件 V6.2 用于生成由使用靶向 CLTC 的
Silencer Select siRNA 进行转染得到的所有 25 种 DEG 的 Log2 比率(CLTC siRNA/阴性对照 #1 siRNA)热图,如图 2 所述。使用欧氏距离平均连接对条件和基因进行聚类。
使用较低的 siRNA 浓度以减少脱靶效应
对
Silencer Select siRNA s477 进行了检测,以确定使用较少的 siRNA 是否能够在不影响靶基因 CLTC 的敲低的情况下减少脱靶差异表达基因的数量。在图 4 中,30 nM 下显示 2 倍或更大差异表达的基因用蓝色表示。对应于 2 倍变化的基因在 X 轴上列出,表达变化的对数比在 Y 轴上绘制。在 30 nM 下使用
Silencer Select siRNA s477 转染产生了 25 种 DEG,但在 3 nM 最终浓度下使用相同 siRNA 转染产生了 6 种 DEG,相较于 30 nM siRNA 转染条件减少了 74%。尽管使用较低 siRNA 浓度使 DEG 显著减少,但 CLTC 靶标敲低几乎没有变化。该实验再次显示了如何在较低浓度下使用
Silencer Select siRNA 以实现等效功能性敲低,并具有特异性显著增加(通过微阵列分析确定)的额外益处。
图 4.较低转染浓度的 Ambion Silencer Select siRNA 会减少脱靶效应。使用 Partek GS V6.2 生成了谱图,图中显示了 3 nM(1 个重复样本阵列)和 30 nM(三份生物学重复样本的平均值)转染(如图 2 所述)的 Log2 比率(Silencer Select siRNA s477/阴性对照 siRNA)。
更清晰、更一致的基于细胞的数据
新款
Silencer Select siRNA 使用基于 SVM 的算法设计而成,包括特异性增强的化学修饰,在高 (100-30 nM) 和低 (3 nM) 浓度下均十分高效且能够实现极大敲低。由于
Silencer Select siRNA 在较低浓度下更高效,因此相较于先前的 siRNA 技术,可以使用相同量的 siRNA 进行更多实验,从而使得这些新款 siRNA 更经济实惠。如本文提供的数据所示,在较低浓度下使用
Silencer Select siRNA 的一个更明显益处是可进一步改善特异性,这一点可通过全局基因表达谱分析衡量得出。具有更高特异性的高功能 siRNA 意味着可以实现更好的基因敲低效果和更少的脱靶效应,最终可在基于细胞的检测中产生更清晰的实验结果。
科学参与人员
Susan Magdaleno, Lesslie Beauchamp, Penn Whitley • Applied Biosystems, Austin, TX