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转染优化对于在培养细胞中进行有意义的 siRNA 实验而言至关重要
GAPDH（甘油醛 3-磷酸脱氢酶）基因是一种丰富且广泛表达的“管家”基因，可进行操作和测量，为培养细胞中的 siRNA 优化实验提供了两倍的效用。首先，通过递送经验证的 Silencer GAPDH siRNA，可在许多细类型中轻松敲低 GAPDH 基因表达。通过测量使用 GAPDH siRNA 转染的细胞（相对于使用阴性对照 siRNA 转染的细胞）中 GAPDH 蛋白水平的下降，可轻松监测 siRNA 递送效率。其次，GAPDH 表达可作为用于鉴定转染产生的细胞毒性的标记物。
轻松优化转染
KDalert 检测试剂盒是 Ambion 产品套件的组成部分，可优化 siRNA 转染到细胞中的过程。特别值得注意的是，
Silencer CellReady™ siRNA 转染优化试剂盒和
Silencer siRNA 转染 II 试剂盒可用于在一系列转染条件下将 GAPDH 和阴性对照 siRNA 递送到细胞中。然后，KDalert 试剂盒可快速鉴别能够尽可能提高沉默同时尽可能减少转染相关细胞毒性的转染条件。一起使用这些试剂盒可帮助研究人员快速确定更好的转染条件，然后可用于相应细胞类型中的所有后续转染。（还有
Silencer siRNA 入门试剂盒可供选择，该试剂盒将这两种产品结合在一起，供刚开始接触 RNAi 的研究人员使用。）
快速测量沉默和细胞活力
为了证明将 Silencer CellReady siRNA 转染优化试剂盒与 KDalert GAPDH 检测试剂盒相结合可轻松实现 siRNA 递送优化，我们使用了这两种试剂盒来优化 HepG2 细胞（可能难以转染的一种细胞类型）中的 siRNA 递送。我们在 96 孔 Silencer CellReady siRNA 转染优化板中创建了一个转染条件基质，其中细胞数量和 siPORT™
NeoFX™ 转染试剂（随附在试剂盒中）的量不同。使用 Silencer GAPDH siRNA 或 Silencer 阴性对照 #1 siRNA 对 HepG2 细胞进行反向转染；将这些 siRNA 作为 Silencer CellReady siRNA 转染优化试剂盒的一部分预分装到板中。转染后两天，去除培养基并使用 KDalert 试剂盒中的试剂和方案裂解细胞。然后使用 KDalert 检测试剂盒测定每个裂解物中的 GAPDH 活性。
图 1 表明，尽管在检测的所有转染条件下均观察到 GAPDH 敲低，但采用 0.6 µL siPORT NeoFX/孔条件时观察到更理想的敲低水平。这些蛋白敲低结果与使用实时 qRT-PCR 获得的 mRNA 敲低结果（在 0.6 µL siPORT NeoFX 条件下观察到理想敲低水平，未显示数据）十分相似。由于在极高转染试剂量（1.2 µL/孔）下细胞毒性是一个问题，因此极佳转染条件确定为 4,000 个细胞和 0.6 µL siPORT NeoFX/孔。
图 1.使用 Silencer CellReady™ 转染优化试剂盒和 KDalert™ GAPDH 检测试剂盒进行快速转染优化。利用 Silencer CellReady siRNA 转染优化板和不同的 siPORT™ NeoFX™ 转染试剂量，使用 Silencer GAPDH 或阴性对照 #1 siRNA 转染了 4,000 和 8,000 个 HepG2 细胞。使用 KDalert 检测试剂盒测量各转染条件下的 GAPDH 表达沉默。残留 GAPDH 活性的测定方法为经 GAPDH siRNA 转染的样本中的 GAPDH 活性除以经阴性对照 #1 siRNA 转染的相应样本中的 GAPDH 活性而得出的比值。另外，通过比较阴性对照 siRNA 转染样本与未处理样本的 GAPDH 活性，使用 KDalert GAPDH 检测试剂盒测量了各转染条件下的转染相关细胞毒性。已鉴别的较佳转染条件以粉红色突出显示。
图 1 表明，尽管在检测的所有转染条件下均观察到 GAPDH 敲低，但采用 0.6 µL siPORT NeoFX/孔条件时观察到更理想的敲低水平。这些蛋白敲低结果与使用实时 qRT-PCR 获得的 mRNA 敲低结果（在 0.6 µL siPORT NeoFX 条件下观察到理想敲低水平，未显示数据）十分相似。由于在极高转染试剂量（1.2 µL/孔）下细胞毒性是一个问题，因此极佳转染条件确定为 4,000 个细胞和 0.6 µL siPORT NeoFX/孔。
图 1.使用 Silencer CellReady™ 转染优化试剂盒和 KDalert™ GAPDH 检测试剂盒进行快速转染优化。利用 Silencer CellReady siRNA 转染优化板和不同的 siPORT™ NeoFX™ 转染试剂量，使用 Silencer GAPDH 或阴性对照 #1 siRNA 转染了 4,000 和 8,000 个 HepG2 细胞。使用 KDalert 检测试剂盒测量各转染条件下的 GAPDH 表达沉默。残留 GAPDH 活性的测定方法为经 GAPDH siRNA 转染的样本中的 GAPDH 活性除以经阴性对照 #1 siRNA 转染的相应样本中的 GAPDH 活性而得出的比值。另外，通过比较阴性对照 siRNA 转染样本与未处理样本的 GAPDH 活性，使用 KDalert GAPDH 检测试剂盒测量了各转染条件下的转染相关细胞毒性。已鉴别的较佳转染条件以粉红色突出显示。
可放心使用优化的转染条件
使用 HepG2 细胞的较佳转染条件来转染靶向四个其他基因（CDK2、STAT1、JAK1 和 PCNA）的 Ambion Silencer 预设计 siRNA。转染后两天，使用实时 qRT-PCR 测量每份转染的 HepG2 样本的基因敲低量（图 2）。使用优化的转染程序高效沉默了各基因靶标。对于这些基因，相较于检测的其他转染优化条件（未显示数据），优化的转染条件实现了较高的靶标沉默水平。
图 2.KDalert™ 优化转染条件使五种不同的基因沉默。利用图 1 中确定的优化条件（4,000 个细胞/孔、0.6 µL siPORT™ NeoFX™/孔），使用靶向五种不同基因的 Silencer 预设计 siRNA 在 96 孔微孔板中转染了 HepG2 细胞。转染后两天，使用实时 qRT-PCR 对各转染培养物中的 mRNA 水平与经阴性对照 #1 siRNA 转染的培养物中的 mRNA 水平进行了比较。
图 2.KDalert™ 优化转染条件使五种不同的基因沉默。利用图 1 中确定的优化条件（4,000 个细胞/孔、0.6 µL siPORT™ NeoFX™/孔），使用靶向五种不同基因的 Silencer 预设计 siRNA 在 96 孔微孔板中转染了 HepG2 细胞。转染后两天，使用实时 qRT-PCR 对各转染培养物中的 mRNA 水平与经阴性对照 #1 siRNA 转染的培养物中的 mRNA 水平进行了比较。
用于 siRNA 转染的 Ambion 完整解决方案
KDalert 检测试剂盒对于用于 siRNA 转染的 Ambion 对照 siRNA 和试剂套件而言是极好的补充。KDalert 程序极易使用、速度极快，使其成为基于 qRT-PCR 的转染优化方法的理想替代方法。
科学参与人员
Luis Foncerrada, Kevin Kelnar • Ambion, Inc.
科学参与人员
Luis Foncerrada, Kevin Kelnar • Ambion, Inc.
KDalert™：简单的 3 步程序利用 KDalert 检测试剂盒使用 GAPDH siRNA 和阴性对照 siRNA 来优化 siRNA 转染。因为 GAPDH 以相对恒定的水平表达，所以该检测试剂盒可用于在同一实验中监测转染试剂诱导的毒性。使用微孔板荧光计或分光光度计，可在不到 30 分钟内可靠地测定培养的人、小鼠或大鼠细胞中的 GAPDH 酶活性。
3 个步骤：
1.转染后两天，向细胞中加入 KDalert 细胞裂解缓冲液；孵育 20 分钟。
2.加入稀释的检测试剂预混液；孵育 4 分钟。
3.使用微孔板或标准荧光计读取荧光值增量或使用分光光度计读取吸光度增量。
3 个步骤：
1.转染后两天，向细胞中加入 KDalert 细胞裂解缓冲液；孵育 20 分钟。
2.加入稀释的检测试剂预混液；孵育 4 分钟。
3.使用微孔板或标准荧光计读取荧光值增量或使用分光光度计读取吸光度增量。