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Ambion 科学家确定了五个可显著改善 siRNA 文库筛选结果的程序。
通过使用 siRNA 文库进行多次 RNAi 筛选，Ambion 科学家确定了五个可显著改善 siRNA 文库筛选结果的程序。
- 尽可能降低细胞毒性
- 降低 siRNA 浓度
- 使用单独、经验证的 siRNA，而非 siRNA 库
- 针对细胞数量进行校正
- 注意细胞类型差异
在此，我们与您分享我们关于实现成功 RNAi 筛选的建议。这些指南将使您的数据更有效。
(1) 尽可能降低细胞毒性
因为筛选实验涉及监测细胞表型，所以在整个实验过程中维持细胞健康非常重要。长期暴露于转染试剂可能会降低细胞活力。在转染后约 24 小时更换孔中的细胞培养基可在不减少靶基因表达的情况下改善细胞活力。更换培养基的最佳时间因细胞类型而异，并取决于细胞对转染试剂的敏感性和摄取 siRNA 的速率。通过以下方式优化这些条件：使用
Silencer™ GAPDH 和阴性对照 siRNA 转染细胞；在转染后 4、8、24、32 小时更换培养基；在转染后 48 至 72 小时测量所有样本的细胞活力和 GAPDH mRNA 或蛋白。
(2) 降低 siRNA 浓度
尽管许多 siRNA 转染仍使用 100 nM siRNA 进行，但已发布的结果表明，以较低的 siRNA 浓度转染可减少一些 siRNA 显示出的非特异性效应 [1]。当以显著较低的浓度转染时，
Silencer™ siRNA 可降低靶标 mRNA 水平（图 1）。为确认 100 nM siRNA 诱导的表型在 siRNA 浓度较低时也会明显表现出来，使用多种浓度的五种不同 siRNA 转染细胞，在表型筛选中发现这些 siRNA 可阻断半胱天冬酶 3 活化（细胞凋亡标记物）。正如 mRNA 研究预测的那样，即使使用非常低的 siRNA 浓度 (10 nM) 进行转染，
Silencer 预设计 siRNA 诱导的表型也基本无差异（图 2）。
图 1. siRNA 浓度 vs. mRNA 敲低。使用 1-100 nM 的 6 种不同 Silencer™ 预设计 siRNA (Ambion) 转染 HeLa 细胞。以 1-3 nM 浓度转染的 siRNA 通常引发高效沉默。
图 2.低 siRNA 浓度在功能检测中有效。使用 9 种不同靶标的特异性 siRNA 转染 HeLa 细胞。在转染后一天，使用依托泊苷处理细胞以诱导细胞凋亡。在转染后三天，裂解细胞并监测半胱天冬酶 3 活性。对各孔的结果进行绘图，结果表示为相对于阴性对照转染样本的平均半胱天冬酶 3 活性。
图 1. siRNA 浓度 vs. mRNA 敲低。使用 1-100 nM 的 6 种不同 Silencer™ 预设计 siRNA (Ambion) 转染 HeLa 细胞。以 1-3 nM 浓度转染的 siRNA 通常引发高效沉默。
图 2.低 siRNA 浓度在功能检测中有效。使用 9 种不同靶标的特异性 siRNA 转染 HeLa 细胞。在转染后一天，使用依托泊苷处理细胞以诱导细胞凋亡。在转染后三天，裂解细胞并监测半胱天冬酶 3 活性。对各孔的结果进行绘图，结果表示为相对于阴性对照转染样本的平均半胱天冬酶 3 活性。
(3) 使用单独、经验证的 siRNA，而非 siRNA 库
siRNA 设计算法使得基本不需要使用低效力 siRNA 库。为说明 siRNA 库是否有利于筛选实验，将（多组）三种 siRNA（靶向 59 种激酶中的每一种）分别按顺序逐一以及作为一个库转染至 HeLa 细胞中（图 3）。
图 3. siRNA 库 vs. 单一 siRNA。在 96 孔板中，转染（一式三份）三种单独 siRNA（图 A；#1、#2、#3）以及 siRNA（靶向 59 种激酶中的每一种）库（图 B；#1+#2+#3）后，单独 HeLa 细胞群中每种激酶的表达水平均降低。使用 Alamar Blue™ (Biosource) 测定细胞数量后，按照图 2 所述进行半胱天冬酶 3 检测。黄色箭头表示通过两种方法确认的靶标结果（即，通过 siRNA 抑制激酶活性可抑制细胞凋亡通路的激活，这可通过半胱天冬酶 3 活性进行测量）。红色箭头表示合并转染的假阴性结果，绿色箭头表示合并转染的假阳性结果。图（图 C）中显示了被确定为阳性、合并检测假阴性、合并检测假阳性和阴性结果的基因的代表性示例。黄线表示用于确定“命中”的 70% 阈值。
监测转染细胞在诱导细胞凋亡后激活半胱天冬酶 3 的能力。“命中”定义为半胱天冬酶 3 活性比阴性对照转染细胞低至少 30% 的细胞。有趣的是，通过 siRNA 库鉴定的命中仅与通过三种单独转染的 siRNA 鉴定的命中部分重叠（图 3A）。
由于我们对经验证的命中的定义是两种 siRNA 在筛选中产生相同表型的基因，因此我们能够使用筛选结果来确定是否可使用单独 siRNA 的结果验证库结果。实际上，仅 60% 的 siRNA 库命中结果可用单独 siRNA 的结果进行验证。未经验证的命中被视为假阳性。库产生的假阳性率为 40%。
更值得关注的是，在有两种或更多单一 siRNA 产生命中结果的 12 个基因中，6 个基因未能在 siRNA 库筛选中标记为命中。观察到库的假阴性率为 50%，这表明使用 siRNA 库进行筛选可能会导致失去鉴定靶基因的机会。确认为阳性、假阳性、假阴性和确认为阴性的采样情况见图 3B。
我们测量了与使用针对每个基因靶标的单一 siRNA 或由三种 siRNA 组成的库进行筛选相关的假阳性和假阴性率。使用 9 种不同的表型检测（包括细胞增殖、细胞形态和细胞骨架形成检测）重复进行 siRNA 库相较于单独 siRNA 的筛选分析。库产生的假阳性率始终高于 50%，假阴性率始终超过 40%（未显示数据）。如图 4 所示，与使用单一 siRNA/靶基因 (#1, #2, #3) 相关的假阳性和假阴性率低于使用 siRNA 库时的相应值。为尽可能减少假阴性（缺失）基因数量和假阳性（未被其他特异性 siRNA 证实）基因数量，研究人员应分析分别使用三种不同基因特异性 siRNA 单独转染的合并结果 (#1+#2+#3)。对于可能无法实现这一点的更大规模筛选实验，相较于使用 siRNA 库的转染，使用一 (#1, #2, #3) 或两种 (#1+#2, #1+#3, #2+#3) 基因特异性 siRNA 的单一 siRNA 转染结果中缺失或假阳性基因的数量仍然有所减少。
图 4.相较于使用 siRNA 库进行筛选，使用单独 siRNA 进行筛选获得的假阳性和假阴性结果更少。通过转染 siRNA 抑制 59 个激酶基因中的 11 个，从而抑制依托泊苷激活的细胞凋亡（通过半胱天冬酶 3 活性进行监测，参见图 3）。根据定义，对确认为阳性的基因的抑制导致在至少两种基因特异性 siRNA 的检测中半胱天冬酶 3 的活性较低。为检测用于鉴定重要基因的筛选方法的准确性，我们分析了涉及靶向相同基因的三种 siRNA 的混合物（siRNA 库）或三种 siRNA 之一 (#1, #2, #3) 的转染实验的结果。
图 3. siRNA 库 vs. 单一 siRNA。在 96 孔板中，转染（一式三份）三种单独 siRNA（图 A；#1、#2、#3）以及 siRNA（靶向 59 种激酶中的每一种）库（图 B；#1+#2+#3）后，单独 HeLa 细胞群中每种激酶的表达水平均降低。使用 Alamar Blue™ (Biosource) 测定细胞数量后，按照图 2 所述进行半胱天冬酶 3 检测。黄色箭头表示通过两种方法确认的靶标结果（即，通过 siRNA 抑制激酶活性可抑制细胞凋亡通路的激活，这可通过半胱天冬酶 3 活性进行测量）。红色箭头表示合并转染的假阴性结果，绿色箭头表示合并转染的假阳性结果。图（图 C）中显示了被确定为阳性、合并检测假阴性、合并检测假阳性和阴性结果的基因的代表性示例。黄线表示用于确定“命中”的 70% 阈值。
监测转染细胞在诱导细胞凋亡后激活半胱天冬酶 3 的能力。“命中”定义为半胱天冬酶 3 活性比阴性对照转染细胞低至少 30% 的细胞。有趣的是，通过 siRNA 库鉴定的命中仅与通过三种单独转染的 siRNA 鉴定的命中部分重叠（图 3A）。
由于我们对经验证的命中的定义是两种 siRNA 在筛选中产生相同表型的基因，因此我们能够使用筛选结果来确定是否可使用单独 siRNA 的结果验证库结果。实际上，仅 60% 的 siRNA 库命中结果可用单独 siRNA 的结果进行验证。未经验证的命中被视为假阳性。库产生的假阳性率为 40%。
更值得关注的是，在有两种或更多单一 siRNA 产生命中结果的 12 个基因中，6 个基因未能在 siRNA 库筛选中标记为命中。观察到库的假阴性率为 50%，这表明使用 siRNA 库进行筛选可能会导致失去鉴定靶基因的机会。确认为阳性、假阳性、假阴性和确认为阴性的采样情况见图 3B。
我们测量了与使用针对每个基因靶标的单一 siRNA 或由三种 siRNA 组成的库进行筛选相关的假阳性和假阴性率。使用 9 种不同的表型检测（包括细胞增殖、细胞形态和细胞骨架形成检测）重复进行 siRNA 库相较于单独 siRNA 的筛选分析。库产生的假阳性率始终高于 50%，假阴性率始终超过 40%（未显示数据）。如图 4 所示，与使用单一 siRNA/靶基因 (#1, #2, #3) 相关的假阳性和假阴性率低于使用 siRNA 库时的相应值。为尽可能减少假阴性（缺失）基因数量和假阳性（未被其他特异性 siRNA 证实）基因数量，研究人员应分析分别使用三种不同基因特异性 siRNA 单独转染的合并结果 (#1+#2+#3)。对于可能无法实现这一点的更大规模筛选实验，相较于使用 siRNA 库的转染，使用一 (#1, #2, #3) 或两种 (#1+#2, #1+#3, #2+#3) 基因特异性 siRNA 的单一 siRNA 转染结果中缺失或假阳性基因的数量仍然有所减少。
图 4.相较于使用 siRNA 库进行筛选，使用单独 siRNA 进行筛选获得的假阳性和假阴性结果更少。通过转染 siRNA 抑制 59 个激酶基因中的 11 个，从而抑制依托泊苷激活的细胞凋亡（通过半胱天冬酶 3 活性进行监测，参见图 3）。根据定义，对确认为阳性的基因的抑制导致在至少两种基因特异性 siRNA 的检测中半胱天冬酶 3 的活性较低。为检测用于鉴定重要基因的筛选方法的准确性，我们分析了涉及靶向相同基因的三种 siRNA 的混合物（siRNA 库）或三种 siRNA 之一 (#1, #2, #3) 的转染实验的结果。
(4) 针对细胞数量进行校正
抑制对细胞分裂或细胞存活至关重要的基因可能会严重影响细胞数量。例如，使用一系列激酶特异性 siRNA 进行初步工作时，我们观察到靶向特异性基因导致转染后三天细胞数量出现约 4 倍差异（图 5）。虽然这种差异对于显微镜检测和测定单个细胞表型的检测而言并不重要，但当使用 ELISA、酶活性检测和测量孔中总信号的其他检测时，必须根据细胞数量将结果归一化。
图 5.使用不同 siRNA 转染的细胞的细胞数量差异。图 A. 使用 siPORT™ NeoFX™ (Ambion)（一式三份），用三种不同的 siRNA（靶向 59 种不同的激酶特异性 siRNA 中的每一种）转染 HeLa 细胞（5,000 个/孔，96 孔板中）。在转染后三天，固定细胞并使用 ArrayScan V (Cellomics) 对细胞进行计数。对多种基因特异性 siRNA 转染孔的平均细胞数量/视场进行了绘图。用不同 siRNA 转染的孔中细胞数量的变异性为约 4 倍，这表明基于孔的检测（例如 ELISA、酶活性检测、报告基因信号测量）的结果必须根据各孔中的细胞数量进行归一化。 图 B. 按照图 A 中所述转染 HeLa 细胞。按照图 3 中所述监测半胱天冬酶 3 活性。绿色箭头表示低于选择阈值的基因，不考虑是否使用归一化；黄色箭头表示仅当根据细胞数量进行归一化时才低于选择阈值的基因；红色表示当根据细胞数量进行归一化时高于选择阈值的基因。
图 5.使用不同 siRNA 转染的细胞的细胞数量差异。图 A. 使用 siPORT™ NeoFX™ (Ambion)（一式三份），用三种不同的 siRNA（靶向 59 种不同的激酶特异性 siRNA 中的每一种）转染 HeLa 细胞（5,000 个/孔，96 孔板中）。在转染后三天，固定细胞并使用 ArrayScan V (Cellomics) 对细胞进行计数。对多种基因特异性 siRNA 转染孔的平均细胞数量/视场进行了绘图。用不同 siRNA 转染的孔中细胞数量的变异性为约 4 倍，这表明基于孔的检测（例如 ELISA、酶活性检测、报告基因信号测量）的结果必须根据各孔中的细胞数量进行归一化。 图 B. 按照图 A 中所述转染 HeLa 细胞。按照图 3 中所述监测半胱天冬酶 3 活性。绿色箭头表示低于选择阈值的基因，不考虑是否使用归一化；黄色箭头表示仅当根据细胞数量进行归一化时才低于选择阈值的基因；红色表示当根据细胞数量进行归一化时高于选择阈值的基因。
(5) 注意细胞类型差异
细胞类型可能会影响 siRNA 筛选结果，如以下示例所示。对转染至 HeLa 细胞中的 siRNA 进行的筛选揭示了其减少会导致细胞增殖缺陷的三个基因。将靶向这三个基因以及其他九个基因的 siRNA 重新转染至 HeLa 细胞以及 HepG2 细胞中。细胞增殖检测证实，在 HeLa 细胞中，减少这三个基因的表达使细胞增殖减少（图 6A）。然而，在 HepG2 细胞中，仅靶向这三个基因之一的 siRNA 使细胞增殖减少。相反，在 HepG2 细胞中，其他两个基因似乎参与了细胞增殖（图 6）。这些结果表明了细胞类型之间的根本差异。不同细胞表达不同基因并具有不同的细胞通路。根据所使用的检测，不同的细胞类型可能揭示不同的命中结果。这一点说明了为所研究的生物学功能选择合适细胞的重要性，并强调了在筛选实验中有机会使用多种细胞类型鉴定许多感兴趣的靶基因。
图 6.对特异性 siRNA 介导的基因抑制的反应因细胞类型而异。用三种靶向 13 个不同基因的 siRNA 或加扰 siRNA 阴性对照转染 HeLa (A) 和 HepG2 (B) 细胞，一式三份。在转染后三天，对细胞进行计数。尽管 MAPK13（棕色）抑制可减少两种细胞类型中的细胞增殖，但 CDK7（红色）和 GAPDH（蓝色）抑制优先减少 HeLa 细胞中的细胞增殖，MAPK12（黄色）优先减少 HepG2 细胞中的细胞增殖。
图 6.对特异性 siRNA 介导的基因抑制的反应因细胞类型而异。用三种靶向 13 个不同基因的 siRNA 或加扰 siRNA 阴性对照转染 HeLa (A) 和 HepG2 (B) 细胞，一式三份。在转染后三天，对细胞进行计数。尽管 MAPK13（棕色）抑制可减少两种细胞类型中的细胞增殖，但 CDK7（红色）和 GAPDH（蓝色）抑制优先减少 HeLa 细胞中的细胞增殖，MAPK12（黄色）优先减少 HepG2 细胞中的细胞增殖。
参考文献1.Jackson AL, Bartz SR, Schelter J, Kobayashi SV, Burchard J, Mao M, Li B, Cavet G, Linsley PS (2003) Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi.Nat Biotechnol.21: 635-7.