高通量 siRNA 递送：示例

在本文“高通量 siRNA 体外递送：从细胞系到原代细胞”中，我们检查了两种高通量 siRNA 递送技术的效率和重现性：反向转染和 96 孔电穿孔。我们发现反向转染与大多数永生化贴壁细胞类型兼容，而电穿孔在向大多数原代细胞和悬浮生长的细胞递送 siRNA 方面更优越。这些方法经过优化后，可实现高细胞活力，同时高效递送 siRNA。最后，虽然最大转染效率和细胞活力因细胞类型而异，但两种方法的 siRNA 递送均具有高度可重现性。针对中等至高通量应用对反向转染和电穿孔进行调整，使其可以向几乎任何类型的细胞递送 siRNA 集或文库，从而能够在每项实验中对数十至数千个基因进行反向遗传学分析。

在此，我们在功能性基因组筛选中使用 174 种不同 siRNA 的反向转染来识别参与细胞增殖的激酶基因。本文中的数据以及先前验证这些高通量递送方法的文章中的数据已发布在 RNA (2005) 11:985–993 [1] 中。该分析提供了可设计的 RNAi 筛选实验类型的示例，并证明了这些筛选在任何具有多通道移液器的实验室中均可行。

本 siRNA 文库筛选的目标是识别在细胞增殖中起作用的激酶基因。为了测量 siRNA 诱导的敲低对细胞增殖的影响，我们使用 alamarBlue (Biosource) 微孔板检测试剂盒监测活细胞数量。alamarBlue 作为代谢细胞功能的指示剂，由活细胞处理成发荧光的消化产物，并可使用荧光板读数仪进行监测。

采用反向转染将靶向 58 种不同人激酶的 174 种 siRNA（每个靶基因 3 种不同的 siRNA）+ 阳性和阴性对照 siRNA 递送至 96 孔板的 HeLa 细胞中。在 Opti-MEM 无血清培养基 (Invitrogen) 中，通过混合 0.3 µL siPORT™ NeoFX™ 转染试剂和 1 pmol siRNA（Silencer CMGC 激酶 siRNA 文库子集），制备转染复合物。然后将 HeLa 细胞铺板于 96 孔板中，同时添加转染复合物。一式三份进行转染。使用多通道移液器时，531 份样本（一式三份制备的 174 个激酶基因 siRNA + 3 个对照 siRNA = 531）的反向转染耗时为 2 小时，包括细胞制备。转染后 72 小时，通过 alamarBlue 检测试剂盒测量细胞增殖。将单个数据点与阴性对照非沉默 siRNA 的结果进行比较（图 1）。


通过实时 RT-PCR 分析样本子集，以定量测定靶标 mRNA 敲低。对于这些样本，在转染后 24 小时使用 MagMAX-96 总 RNA 分离试剂盒分离总 RNA。使用 RETROscript 试剂盒，利用随机十聚体对经 DNase 处理的纯化 RNA 进行逆转录。然后在 ABI Prism 7900 SDS (Applied Biosystems) 上通过实时荧光定量 PCR 测定基因表达水平。扩增 18S rRNA 作为内源性对照，以针对起始模板量中的孔间变异进行调整。使用三种不同的非沉默 siRNA（ Silencer 阴性对照 #1、#2、#3 siRNA）单独转染样本，从中获得平均值，将上述校正值归一化为该平均值。

筛选识别出几种激酶，其下调似乎可抑制或增强细胞增殖。就这几种激酶基因而言，对于靶向同一靶标的三种 siRNA 中的每种，每孔的细胞数量显著不同。这些 siRNA 将靶标 mRNA 表达降低至相似水平（未显示数据）。鉴于 siRNA 可靶向非预期基因 [2]，我们怀疑在仅一种 siRNA 引起效应的情况下，除了预期激酶外，siRNA 还靶向对细胞增殖至关重要的不同基因。该结果显示了在筛选中每个靶标使用三种不同 siRNA 的优势。事实上，在大多数情况下，两种或三种 siRNA 改变细胞数量的程度相似，我们能够得出结论，敲低这些激酶会直接影响细胞数量。

筛选识别出 5 个基因，在这些靶标基因中添加两种或三种 siRNA 导致细胞数量低于正常值（图 2）。这些基因的敲低可能是由于细胞增殖缺陷或其他细胞机制所致。筛选还识别 5 个基因，当被至少两种不同的 siRNA 敲低时，导致细胞数量高于正常值。识别出的几个基因（如 CDK7、CDK11、CDK2、CDC2L1 和 RAGE）与细胞周期调节相关 [3-7]。

双链 RNA 文库筛选能够对参与细胞凋亡、吞噬作用、细胞增殖、细胞周期、p53 介导的衰老、细胞形态发生、胞质分裂和信号转导的基因进行分类 [8-14]。由于可获得 siRNA 文库，使得可以评估单个基因表达的顺序降低对细胞过程的影响，为人类和啮齿动物细胞中的应用提供了一个强大的反向遗传学工具。在筛选研究中有效使用 siRNA 文库的关键是能够将数百或数千个活性 siRNA 高效递送至细胞，同时尽可能降低与递送方法相关的细胞毒性。

NCBI 概要目前列出了 5500 多个功能未知的人类基因。因此，siRNA 筛选实验为基因功能的发现提供了明显的机会。市面上有数十种酶和生物检测试剂盒可用于表型筛选。Ambion 致力于开发能够简化高通量 siRNA 递送过程的试剂和技术，即使是没有自动化能力的小型实验室也能使用。除了为每个人类、小鼠和大鼠基因提供几种高效的 siRNA（超过 200,000 种 siRNA）外，Ambion 还为人类基因靶标提供了多种 siRNA 文库（按功能级别分组）以供选择