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pSilencer™ 5.1 Retro 系统
pSilencer™ 5.1 Retro 系统使研究人员能够研究减少细胞培养模型中特异性基因表达的长期影响。这些逆转录病毒载体使用 H1 或 U6 聚合酶 III 启动子稳定表达 siRNA，即使在难以转染的细胞类型中也是如此。该技术扩展了 RNA 干扰研究，以应对导致疾病表型的基因表达的长期改变。
介绍：使用病毒使 siRNA 进入细胞
使用 siRNA 诱导基因沉默有巨大的潜力，可用于识别和了解基因功能，最终可能被用作治疗策略。生成 siRNA 分子的方法包括化学合成、酶合成以及基于 DNA 的表达载体。通常，对于大多数瞬时实验而言，通过化学合成在体外生成 siRNA 是首选方法。然而，在进行长期 RNAi 研究或在 siRNA 特别难以递送的细胞或生物体中进行研究时，基于 DNA 的方法具有明显的优势。
DNA 介导的 siRNA 表达技术可分为病毒法和非病毒法。两者均涉及一个短发夹 RNA 转录本的表达，该转录本经内源处理成为 siRNA。尽管非病毒介导的方法对于瞬时 RNA 干扰实验有效，但转染效率较低是生成稳定 siRNA 表达细胞系过程中的常见障碍，且在进行动物研究时也会造成严重限制。（通常，化学合成 siRNA 是可用于大多数无限增殖化细胞系的瞬时实验的更好选择。）相反，病毒方法能够有效地将 siRNA 递送至许多难以转染的细胞类型，包括原代细胞，因为感染是比转染更有效的递送机制。此外，因为逆转录病毒通常会整合到宿主的基因组中，所以利用这些构建体相对易于长期稳定地减少基因表达。
包括 Ambion 在内的几个组可为 siRNA 表达提供腺病毒、逆转录病毒和其他病毒载体。例如，Ambion 的 pSilencer adeno 1.0-CMV 系统（货号 5790）提供了一种腺病毒介导的方法，可将 siRNA 递送至细胞和动物中。p Silencer adeno 载体适用于在难转染细胞和动物组织中实现 siRNA 瞬时表达。
现在，Ambion 推出了一种逆转录病毒系统（ pSilencer 5.1 Retro 系统），有助于在哺乳动物系统研究中稳定表达 siRNA（请参见边栏，生产作为研究工具的逆转录病毒）。p Silencer 逆转录病毒载体可通过将 siRNA 高效递送至各种细胞（包括难转染的原代细胞）来高效诱导基因沉默。该系统同样是长期稳定敲低基因表达的理想选择，这对于了解和研究有关减少疾病相关基因的表达随着时间的推移引发疾病表型的原理至关重要。
本文介绍了如何使用 Ambion 的逆转录病毒系统在转化和原代细胞类型中诱发 RNAi。即使在极难转染的原代细胞类型 NHDF-neo 细胞中仍能观察到强基因沉默。此外，在一项持续时间超过 8 个月的实验中使用 p Silencer 5.1 Retro 系统长期稳定地减少了基因表达。令人惊讶的是，只有在极长期的基因沉默之后，细胞形态的一些变化和生长特性的差异才变得明显。
DNA 介导的 siRNA 表达技术可分为病毒法和非病毒法。两者均涉及一个短发夹 RNA 转录本的表达，该转录本经内源处理成为 siRNA。尽管非病毒介导的方法对于瞬时 RNA 干扰实验有效，但转染效率较低是生成稳定 siRNA 表达细胞系过程中的常见障碍，且在进行动物研究时也会造成严重限制。（通常，化学合成 siRNA 是可用于大多数无限增殖化细胞系的瞬时实验的更好选择。）相反，病毒方法能够有效地将 siRNA 递送至许多难以转染的细胞类型，包括原代细胞，因为感染是比转染更有效的递送机制。此外，因为逆转录病毒通常会整合到宿主的基因组中，所以利用这些构建体相对易于长期稳定地减少基因表达。
包括 Ambion 在内的几个组可为 siRNA 表达提供腺病毒、逆转录病毒和其他病毒载体。例如，Ambion 的 pSilencer adeno 1.0-CMV 系统（货号 5790）提供了一种腺病毒介导的方法，可将 siRNA 递送至细胞和动物中。p Silencer adeno 载体适用于在难转染细胞和动物组织中实现 siRNA 瞬时表达。
现在，Ambion 推出了一种逆转录病毒系统（ pSilencer 5.1 Retro 系统），有助于在哺乳动物系统研究中稳定表达 siRNA（请参见边栏，生产作为研究工具的逆转录病毒）。p Silencer 逆转录病毒载体可通过将 siRNA 高效递送至各种细胞（包括难转染的原代细胞）来高效诱导基因沉默。该系统同样是长期稳定敲低基因表达的理想选择，这对于了解和研究有关减少疾病相关基因的表达随着时间的推移引发疾病表型的原理至关重要。
本文介绍了如何使用 Ambion 的逆转录病毒系统在转化和原代细胞类型中诱发 RNAi。即使在极难转染的原代细胞类型 NHDF-neo 细胞中仍能观察到强基因沉默。此外，在一项持续时间超过 8 个月的实验中使用 p Silencer 5.1 Retro 系统长期稳定地减少了基因表达。令人惊讶的是，只有在极长期的基因沉默之后，细胞形态的一些变化和生长特性的差异才变得明显。
启动子的选择可实现极佳的基因敲低
Ambion 提供两种 pSilencer 5.1 Retro 载体—一种具有聚合酶 III U6 启动子，一种具有聚合酶 III H1 启动子。siRNA 从这些启动子进行差异性表达；因此，启动子的选择可影响基因沉默的水平。为了证明这一点，将编码靶向几个基因（包括亲环蛋白 A、GAPDH、ATM、BRCA-1 和 CDK2）的 siRNA 发夹结构的插入片段克隆到含有 U6 和 H1 启动子的 pSilencer 逆转录病毒载体中。使用所得病毒感染的 HeLa 细胞用嘌呤霉素进行选择。分析存活细胞 mRNA 水平降低的情况。图 1A 显示了 mRNA 表达减少差异取决于哪种启动子驱动了 siRNA 表达。例如，与通过 U6 启动子表达时相比，当通过 H1 启动子表达其各自的 siRNA 插入片段时，ATM 和亲环蛋白的 mRNA 水平出现更强烈地下降。相反，与 H1 启动子相比，当 U6 启动子用于表达 BRCA-1 siRNA 时，BRCA-1 mRNA 水平出现更强烈地下降。
图 1.siRNA 逆转录病毒递送后的基因沉默。将通过 H1 或 U6 启动子表达指示 siRNA 插入片段的逆转录病毒载体转染到 6 孔板中的逆转录病毒包装细胞系中。感染三天后，采集病毒并用于感染一式三份 HeLa 细胞。(A) 对感染 HeLa 细胞进行嘌呤霉素选择（4 天）。持续生长两个月后，从细胞中纯化 RNA，并通过实时荧光定量 PCR 分析靶基因表达水平。相对于表达阴性对照 siRNA 的细胞表示数据。标准差均低于 5%。(B) 使用 mirVana™ miRNA 分离和检测试剂盒 (Ambion) 监测经 H1 启动子 (H1CDK2) 调节的 CDK2 siRNA 表达水平。
为了测量感染细胞中的 siRNA 表达水平，使用 mirVana™ miRNA 分离试剂盒 (Ambion) 纯化小 RNA，并使用 mirVana miRNA 检测试剂盒 (Ambion)（基于溶液的杂交测定试剂盒）鉴别特异性 siRNA。如图 1B 所示，CDK2 siRNA 可稳健表达。（注：siRNA 表达水平与后续靶基因敲低之间的相关性在研究的 siRNA 中有所不同。这是因为一些 siRNA 在诱发高效沉默方面比其他 siRNA 更有效。）
为了实现极大量的 siRNA 表达和后续靶基因沉默，针对所研究的每个基因分析两种启动子系统可能是有利的。Ambion 的新型 p Silencer 5.1 Retro 系统可出于此目的为每种聚合酶 U6 和 H1 启动子提供载体。因为两种载体使用相同的限制性位点，所以可以轻松地将 siRNA 编码插入片段克隆到另一载体中。
图 1.siRNA 逆转录病毒递送后的基因沉默。将通过 H1 或 U6 启动子表达指示 siRNA 插入片段的逆转录病毒载体转染到 6 孔板中的逆转录病毒包装细胞系中。感染三天后，采集病毒并用于感染一式三份 HeLa 细胞。(A) 对感染 HeLa 细胞进行嘌呤霉素选择（4 天）。持续生长两个月后，从细胞中纯化 RNA，并通过实时荧光定量 PCR 分析靶基因表达水平。相对于表达阴性对照 siRNA 的细胞表示数据。标准差均低于 5%。(B) 使用 mirVana™ miRNA 分离和检测试剂盒 (Ambion) 监测经 H1 启动子 (H1CDK2) 调节的 CDK2 siRNA 表达水平。
为了测量感染细胞中的 siRNA 表达水平，使用 mirVana™ miRNA 分离试剂盒 (Ambion) 纯化小 RNA，并使用 mirVana miRNA 检测试剂盒 (Ambion)（基于溶液的杂交测定试剂盒）鉴别特异性 siRNA。如图 1B 所示，CDK2 siRNA 可稳健表达。（注：siRNA 表达水平与后续靶基因敲低之间的相关性在研究的 siRNA 中有所不同。这是因为一些 siRNA 在诱发高效沉默方面比其他 siRNA 更有效。）
为了实现极大量的 siRNA 表达和后续靶基因沉默，针对所研究的每个基因分析两种启动子系统可能是有利的。Ambion 的新型 p Silencer 5.1 Retro 系统可出于此目的为每种聚合酶 U6 和 H1 启动子提供载体。因为两种载体使用相同的限制性位点，所以可以轻松地将 siRNA 编码插入片段克隆到另一载体中。
原代细胞系的基因表达敲低
除转化细胞外，在通常极难转染的原代细胞系 NHDF-neo 细胞中也观察到靶基因沉默。生成表达阴性对照 siRNA 或靶向亲环蛋白的 siRNA 的逆转录病毒，用其感染 HeLa 细胞和一种原代 NHDF-neo 细胞类型（在存在 2 µg/mL Sequa-brene™ (Sigma-Aldrich) 的情况下在 24 孔板中铺板培养 NHDF-neo 细胞，以增强病毒摄取）。分别使用 1、1.5 和 2 µg/mL 嘌呤霉素选择感染细胞。此外，采用未转染病毒 DNA 的包装细胞上清液进行对照感染。
使用嘌呤霉素杀灭对照细胞后，取出抗生素选择实验（约 4 天）中的实验细胞。收获一部分细胞，以分析接受亲环蛋白 siRNA 的细胞中的亲环蛋白表达相较于接受阴性对照 siRNA 的细胞中的亲环蛋白表达。通过长期培养让剩余细胞增殖。在两种细胞类型中，表达亲环蛋白 siRNA 的 pSilencer 逆转录病毒载体均有效降低了亲环蛋白 mRNA 水平，表明存在有效的 siRNA 递送和表达（图 2）。事实上，亲环蛋白的基因沉默在原代 NHDF-neo 细胞中比在 HeLa 细胞中更有效，表明某些插入片段在一个细胞系中可能比在另一个细胞系中更有效。
图 2.用于在原代细胞中诱发 RNAi 的逆转录病毒递送。将通过 H1 启动子表达亲环蛋白 A siRNA 或阴性对照 siRNA (nc) 的逆转录病毒转染至 6 孔板中的包装细胞系中，一式三份。转染后三天，采集病毒并用于感染 HeLa 细胞或 NHDF-neo 细胞。对细胞进行选择（4 天），培养两个月后，通过实时荧光定量 PCR 分析亲环蛋白表达。将这些细胞中的亲环蛋白表达与使用表达阴性对照 siRNA 的病毒感染的细胞中的表达水平进行比较。标准差低于 5%。
在该实验中，亲环蛋白 mRNA 水平降低的 NHDF-neo 细胞变为“病态”（显示出细胞死亡增加），并且两个月后这些细胞不再能增殖；培养其余的细胞，直至其最终死亡。相反，亲环蛋白表达减少的 HeLa 细胞未显示相同的细胞死亡水平，并且仍可扩增，但细胞表现出形态变化（图 3C）。原代 NHDF-neo 细胞培养物与转化 HeLa 细胞系之间的形态学差异可能是亲环蛋白减少差异所致，因为与 HeLa 细胞相比，NHDF-neo 细胞中的亲环蛋白水平出现了更有效的降低。它们也可能是两种细胞类型之间的生物学差异所致；例如，其克服或适应亲环蛋白表达减少的能力存在差异。需要使用表达不同 siRNA 水平的感染细胞克隆群进行其他实验，以区分这两种情况。
使用嘌呤霉素杀灭对照细胞后，取出抗生素选择实验（约 4 天）中的实验细胞。收获一部分细胞，以分析接受亲环蛋白 siRNA 的细胞中的亲环蛋白表达相较于接受阴性对照 siRNA 的细胞中的亲环蛋白表达。通过长期培养让剩余细胞增殖。在两种细胞类型中，表达亲环蛋白 siRNA 的 pSilencer 逆转录病毒载体均有效降低了亲环蛋白 mRNA 水平，表明存在有效的 siRNA 递送和表达（图 2）。事实上，亲环蛋白的基因沉默在原代 NHDF-neo 细胞中比在 HeLa 细胞中更有效，表明某些插入片段在一个细胞系中可能比在另一个细胞系中更有效。
在该实验中，亲环蛋白 mRNA 水平降低的 NHDF-neo 细胞变为“病态”（显示出细胞死亡增加），并且两个月后这些细胞不再能增殖；培养其余的细胞，直至其最终死亡。相反，亲环蛋白表达减少的 HeLa 细胞未显示相同的细胞死亡水平，并且仍可扩增，但细胞表现出形态变化（图 3C）。原代 NHDF-neo 细胞培养物与转化 HeLa 细胞系之间的形态学差异可能是亲环蛋白减少差异所致，因为与 HeLa 细胞相比，NHDF-neo 细胞中的亲环蛋白水平出现了更有效的降低。它们也可能是两种细胞类型之间的生物学差异所致；例如，其克服或适应亲环蛋白表达减少的能力存在差异。需要使用表达不同 siRNA 水平的感染细胞克隆群进行其他实验，以区分这两种情况。
图 3.靶基因表达长期减少会导致形态变化。将通过 H1 启动子表达亲环蛋白 A、BRCA 1 或阴性对照 siRNA 的逆转录病毒 DNA 转染至 6 孔皿中的包装细胞系中，一式三份。三天后，采集病毒并用于感染 HeLa 细胞。对 HeLa 细胞进行嘌呤霉素选择（4 天）。(A) 在 8 个月内定期分析细胞的基因减少情况。数据描述为相较于表达阴性对照 siRNA (nc) 的细胞的基因表达百分比，标准差低于 5%。(B) 还使用 mirVana™ miRNA 检测试剂盒 (Ambion) 分析了细胞的 siRNA 插入片段表达（8 个月时间点）。(C) 在选择后培养 8 个月后，观察了表达亲环蛋白和 BRCA1 siRNA 的细胞的形态变化。
基因表达的稳定敲低
通过 siRNA 实现的基因表达长期稳定减少有可能模拟某种基因未表达或出现突变的特定疾病状态。为进一步考察基因表达长期稳定敲低的影响，制备了表达靶向多个基因（包括亲环蛋白和 BRCA1）的 siRNA 的 pSilencer 5.1–H1 Retro 载体。感染并选择细胞后，使用 qRT-PCR 确认靶标 mRNA 的降低，然后对细胞进行培养和传代 8 个月。
观察到一些关于细胞形态的有趣结果。即使在靶基因表达减少持续 1-2 个月的细胞中，形态变化最初也并不明显；然而，与表达阴性对照 siRNA 的稳定细胞系相比，亲环蛋白和 BRCA1 表达长期减少的细胞开始显示出显著表型差异（图 3C）。虽然 BRCA1 mRNA 水平是表达阴性对照 siRNA 的细胞中相应观测水平的 60%（图 3A、B），但在表达 BRCA1 siRNA 的细胞中出现了明显的形态学表型。因此，mRNA 水平的相对降幅并非始终要达到 70% 或以上才能实现形态学响应。事实上，基因表达长期减少并达到更适宜的水平就可以模拟导致异质性疾病的等位基因（如 BRCA1）的影响，在此情况下，只需要其中一个等位基因发生突变就能显示出疾病表型，通常需要很长时间才能出现此情况。
观察到一些关于细胞形态的有趣结果。即使在靶基因表达减少持续 1-2 个月的细胞中，形态变化最初也并不明显；然而，与表达阴性对照 siRNA 的稳定细胞系相比，亲环蛋白和 BRCA1 表达长期减少的细胞开始显示出显著表型差异（图 3C）。虽然 BRCA1 mRNA 水平是表达阴性对照 siRNA 的细胞中相应观测水平的 60%（图 3A、B），但在表达 BRCA1 siRNA 的细胞中出现了明显的形态学表型。因此，mRNA 水平的相对降幅并非始终要达到 70% 或以上才能实现形态学响应。事实上，基因表达长期减少并达到更适宜的水平就可以模拟导致异质性疾病的等位基因（如 BRCA1）的影响，在此情况下，只需要其中一个等位基因发生突变就能显示出疾病表型，通常需要很长时间才能出现此情况。
pSilencer Retro 系统
此处提供的数据强调了使用逆转录病毒介导的 siRNA 的递送在转化和原代细胞培养物中基因表达长期减少方面的效用。pSilencer 5.1 Retro 系统已经过线性化，可用于克隆。为方便起见，新载体具有与原始 pSilencer 质粒载体系列兼容的限制性位点。该系统可帮助研究人员进行长期基因沉默研究，以揭示在瞬时或短期实验中未检出的细胞表型。
科学参与人员
Lance P Ford*、Kevin Kelnar 和 Lesslie Beauchamp • Ambion, Inc.
科学参与人员
Lance P Ford*、Kevin Kelnar 和 Lesslie Beauchamp • Ambion, Inc.
生产作为研究工具的逆转录病毒利用病毒质粒 DNA 生产逆转录病毒颗粒需要病毒包装细胞系，其中许多是市售的产品。包装细胞含有病毒形成和复制所必需的病毒基因（即 gag、pol 和 env）。这些病毒基因已经从病毒质粒 DNA 中删除，可形成无复制能力的颗粒。在插入转基因后，将转基因病毒质粒 DNA 转染至包装细胞系中，以生成含有亚克隆 DNA 的病毒颗粒。所得病毒制备液可用于感染宿主细胞。该病毒将整合到宿主细胞染色体中，使得转基因（在这种情况下为 siRNA）的组成型表达达到较高水平