RNAi 沉默基因表达的能力和效用使其成为真核系统中反向遗传学所选的工具。在哺乳动物系统中常使用 RNAi 的应用包括：基因功能的检测假设、功能性筛选和识别靶基因、验证基因作为潜在药物靶标以及检查使用短干扰 RNA (siRNA) 作为治疗剂。

本文描述了在使用实时 RT-PCR 评估 siRNA 效应时，如何确定剩余基因表达百分比和基因表达敲低百分比。它还讨论了这些计算对变更的影响。

计算剩余基因表达% 和敲低%

用于相对定量测定的比较性 C T 方法 (ΔΔC T) 是用于测定使用 TaqMan 基因表达检测试剂盒时 siRNA 诱导的特定基因沉默或敲低的常用方法。在这种方法中，使用对照转录本（例如 18S rRNA）对数据进行归一化，并将实验样本中感兴趣基因的归一化表达值 (ΔC T) 与阴性对照 siRNA 处理样本 (NC) 中的相等 ΔC T 进行比较。

  • 使用两种 TaqMan 检测试剂盒评估实验样本（例如来自 siRNA 转染细胞的 RNA）：一种测定感兴趣基因（例如 GAPDH）的 RNA 水平，一种测定内源性校准品 RNA（例如 18S rRNA）。归一化表达值 ΔCT-Sample 计算如下：ΔCT-Sample =（带 GAPDH 引物/探针的 CT-Sample - 带 18S rRNA 引物/探针的 CT-Sample）
  • 还需要非靶向阴性对照 siRNA 转染的 RNA 样本。还使用与用于评估实验样本相同的 TaqMan 检测试剂盒评估阴性对照样本。ΔCT-NC 计算如下：
  • ΔCT-NC =（带 GAPDH 引物/探针的 CT-NC - 带 18S rRNA 引物/探针的 CT-NC）
  • 通过计算 ΔΔCT 比较实验样本和阴性对照中靶基因的归一化表达值：
  • ΔΔCT = ΔCT-Sample - ΔCT-NC
  • ΔΔCT 可用于计算剩余基因表达百分比和敲低百分比

了解数据的变异性

将 ΔΔC T 转化为基因表达水平（剩余基因表达百分比或基因敲低百分比）的公式会导致样本变异性情况失真。相较于 ΔΔC T 较大的情况，ΔΔC T 较小时，剩余基因表达百分比或敲低百分比的增量变化更大，因为其中一个 C T 值代表 2 倍的变化。样本在原始 C T 水平、ΔC T-NC、ΔC T-Sample 或最终 ΔΔC T 水平下具有相似的精度，但在剩余基因表达百分比或敲低百分比方面却显示出较大变异性（图 2）。有关精度和准确度的简要讨论，请参见第 10 页的边栏。


图 2.数据变异性意味着识别靶标的能力方面存在较大变异。随着剩余基因表达百分比下降和敲低百分比增加，变异性消失。


  • 1-9 行（图 2A）显示了 0.25 的 ΔΔCT 增量变化如何将剩余基因表达百分比和敲低百分比从 0 变为 2 ΔΔCT。剩余基因表达百分比范围为 100% 至 25%，这对应的敲低百分比为 0%-75%。
  • 10-14 行显示了 3 至 7 ΔΔCT 范围内 1.0 的 ΔΔCT 增量变化。剩余基因表达变化为 12.5%-0.78%（略高于 11%）。相应的 11% 变化时，敲低变化范围为 87.5% 至 99.2%。
  • 15-22 行显示了 8 至 15 ΔΔCT 范围内 1.0 的 ΔΔCT 增量变化。尽管 ΔΔCT 水平存在该较大范围变化，但剩余基因表达量变化小于 0.4%。在 ΔΔCT（8 至 15 ΔΔCT）中散布的 7 个点中，敲低仅在 99.6% 至 100% 范围内变化。

ΔΔC T、剩余基因表达百分比和敲低百分比的变异性比较图示见图 2B 和 2C。

原始实时检测试剂盒的精度在低或高 ΔΔC T 值时相同。然而，当 ΔΔC T 值较低时，即使较小的变异性也会导致敲低百分比的较大变化，从而在本质上更难识别靶基因。随着 ΔΔC T 值的增加，计算的变异性似乎会减小，从而更容易识别靶基因。这在查看不同样本剩余基因表达百分比或敲低百分比的图和误差线时非常重要。即使敲低计算中使用的原始数据与敲低量较低且误差线显示较大的其他样本一样可变，具有更高敲低的样本的误差线也会显示较小。


图 3.呈正态分布的数据的准确度和精度示例。浅棕色线表示检测的答案为“真”（零）。黑色线表示精确和准确的结果 (0 ± 1)。蓝色曲线显示不太精确（变异性增加）但仍准确定义平均值的数据 (0 ± 10)。绿色曲线表示相较于黑色或蓝色曲线所绘制的数据，变异较大、准确度较小的数据 (10 ± 10)，但这些数据在一定时间内是正确的。橙色曲线代表非常精确的数据 (10 ± 1)；然而，数据不准确，因为它不包括正确的答案。