目前有六种新款 p Silencer™ siRNA 表达载体可供选择，每种载体都具有抗生素抗性基因，方便在培养的哺乳动物细胞中进行选择。这些新载体适用于对基因特异性敲低进行长期研究。哺乳动物细胞中的基因特异性沉默可通过使用 siRNA 诱导 RNA 干扰途径轻松实现。相较于通过化学合成、体外转录或 RNase III 消化长 dsRNA 制备的 siRNA，使用 siRNA 表达载体具有以下优势：能够进行长期基因沉默研究，并且无需直接处理 RNA。

siRNA 表达载体的工作原理

在哺乳动物细胞内表达 siRNA 的载体通常使用 RNA 聚合酶 III 启动子来驱动模拟 siRNA 结构的短发夹 RNA 的表达（参见边栏中的“为什么使用 RNA 聚合酶 III 启动子？”）。编码发夹的插入片段有两个反向重复序列，由短的间隔序列隔开（图 1）。一个反向重复序列与 siRNA 所靶向的 mRNA 互补。3' 末端添加有一串胸苷，作为 pol III 转录终止位点。（参见边栏中的“载体编码 siRNA 的设计”）。进入细胞后，载体组成性地表达发夹 RNA，从而诱导靶基因沉默。

图 1.典型 siRNA 表达载体的示意图。A. 编码插入片段的 siRNA。 B. 载体。 C. 发夹 siRNA。

选择标记适用于长期研究

使用带有抗生素抗性基因的哺乳动物 siRNA 表达载体可带来诸多益处。选择标记能够帮助弥补在一些细胞系中观察到的质粒转染效率低下这一不足。在这些情况下，只有一小部分的转染细胞能够表达 siRNA，即使使用高效 siRNA，也难以检测到靶基因表达的降低。可通过短暂使用抗生素来富集摄取了含标记质粒的细胞群。这意味着可从 siRNA 表达质粒转移至细胞的效率较低的实验中获得有用的结果。

此外，使用选择标记可对摄取 siRNA 表达载体的细胞进行长期基因沉默研究。如果基因表达降低导致的表型变化在转染后仅数天的时间内并不明显，则可进行数周的观察。

带有嘌呤霉素、新霉素和潮霉素选择标记的 siRNA 表达载体

六种带有抗生素选择标记的 pSilencer siRNA 表达载体现可从 Ambion 购买（请单击此处查看比较图表）。这些载体具有与 pSilencer 2.0-U6 和 pSilencer 3.0-H1 siRNA 表达载体相同的启动子、氨苄青霉素抗性基因和大肠杆菌复制起点，此外还带有一个抗生素抗性基因，具有额外的益处。

  • pSilencer 2.1-U6 puro 和 pSilencer 3.1-H1 puro 含有抗性基因 pac，可对嘌呤霉素产生抗性。
  • pSilencer 2.1-U6 hygro 和 pSilencer 3.1-H1 hygro 含有抗性基因 hph，可使潮霉素失活。
  • pSilencer 2.1-U6 neo 和 pSilencer 3.1-H1 neo 含有新霉素抗性基因，可对抗生素 G418 产生抗性。

所有六种 siRNA 表达质粒均可用于对已摄取质粒并表达抗性基因的细胞进行选择。

为了演示 Ambion 新推出的含选择标记的 pSilencer siRNA 表达载体的使用，将编码 GFP 特异性 siRNA 的 pSilencer 2.1-U6 hygro 转染至表达 GFP 的 HeLa 细胞，并用抗生素潮霉素进行选择（图 2）。转染后 3 周，通过荧光显微镜分析 GFP 水平。相较于使用不含插入片段的 pSilencer 2.1-U6 hygro 转染的细胞，GFP 水平降低了 94%。这种基因表达的降低维持了至少 4 周。

含有选择标记的 pSilencer 载体附带 (1) 可直接用于连接的线性化和纯化载体；(2) 编码 GFP 特异性 siRNA 的 DNA 插入片段；(3) 可表达加扰对照 siRNA 的环状阴性对照 pSilencer 载体；(4) 1X DNA 退火溶液。


图 2.使用 pSilencer™ 2.1-U6 hygro 实现 GFP 的长期沉默。使用含有插入片段（在人 U6 启动子控制下编码靶向周期 3 GFP 的 siRNA）的 pSilencer 2.1-U6 hygro（图 A）或不含 siRNA 编码插入片段的 pSilencer 2.1-U6 hygro（图 B）转染表达周期 3 GFP 的 HeLa 细胞。转染后，用潮霉素选择细胞。选择后三周，通过荧光显微镜检查对细胞的 GFP 表达进行分析。绿色：GFP。蓝色：DAPI 染色细胞核。与使用“空”siRNA 表达载体转染的细胞相比，使用 GFP siRNA 编码 pSilencer 2.1-U6 hygro siRNA 表达载体转染的细胞中的 GFP 水平显著降低 (94%)。

为什么使用 RNA 聚合酶 III 启动子？

在迄今为止描述的大多数 siRNA 表达载体中，使用了三种不同 RNA 聚合酶 III (pol III) 启动子中的一种来驱动小发夹 siRNA 的表达 (1-5)。这些启动子包括已充分表征的人和小鼠 U6 启动子以及人 H1 启动子。选择 RNA pol III 来驱动 siRNA 表达的原因是它可在哺乳动物细胞中表达相对大量的小 RNA，并且在掺入一串 3-6 个尿苷后可终止转录。后一个特点特别重要，因为 siRNA 与 mRNA 靶标杂交需要明确确定的 3' 末端 (6)。选择用于 siRNA 载体设计的 U6 和 H1 启动子是因为它们相对简单，并且它们完全位于转录序列的上游。这样就无需在 siRNA 内包含启动子序列。Ambion 提供了带有三个不同启动子的表达载体，因为这些启动子驱动表达的 siRNA 数量和位置可能因细胞类型的不同而有所差异。