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siRNA 文库可将基因与细胞功能联系起来
Ambion 开发了靶向重要基因类别（包括激酶、离子通道、受体类别、分子马达和许多其他类别）的人类 siRNA 文库（图 1）。将这些 siRNA 文库应用于细胞培养筛选可揭示对细胞功能至关重要的人类基因。可使用 siRNA 文库表征的细胞功能多样性仅受可开发的表型检测范围的限制。使用 siRNA 文库，您将能够比以往更快速、更轻松地鉴定至关重要的人类基因。
图 1.Ambion siRNA 文库。
Ambion 的科学家已使用多个 Silencer™ siRNA 文库进行定量检测，以鉴定参与细胞凋亡、细胞增殖、TRAIL 诱导和 p53 活化的基因。下文提供了高效筛选过程的总体概述。
筛选过程概述
(1) 开发一种定量检测方法，以监测所研究的细胞过程。
测量细胞表型强度的检测包括监测细胞大小、细胞周期状态或抗体染色的显微镜检测；用于评估细胞裂解物中特定底物的转化情况的酶促试验；直接测量裂解物、细胞或培养基中的生物分子或小分子。
成功的筛选必须使用可定量测定细胞表型并尽可能提高信噪比的检测。高效检测必须包括高质量阳性和阴性对照 siRNA。将阳性对照 siRNA 转染至细胞中时，其应产生所需表型，理想情况下阳性对照 siRNA 的靶标应为已知在所研究的过程中发挥作用的基因。例如，如果目标是鉴定由特定分子刺激后信号转导通路涉及的基因，则转染靶向分子受体的 siRNA 应破坏细胞信号转导并产生所需表型。同样，阴性对照 siRNA 对检测结果应基本无影响，其应与未转染或模拟转染细胞相当。
尽可能提高信噪比涉及检测变量，如检测时间、检测组分（即报告基因）、细胞类型和转染与检测之间的时长。阳性对照与阴性对照之间的检测结果差异越大，筛选结果覆盖面越大，因此，鉴定出感兴趣基因的机会越高。
(2) 针对所需细胞优化转染条件。
第一步是确定转染试剂和铺板条件，尽可能增加活性 siRNA 的摄取，同时保持高细胞活力。我们发现，在使用 2-5 种不同转染试剂进行转染（当使用细胞系时）或者以 5-10 种电穿孔条件（例如，改变细胞浓度、电压、脉冲长度、脉冲数、siRNA 浓度等）进行转染（当使用原代或悬浮细胞时）的细胞中测量敲低情况和细胞活力很有用。然后可针对试剂或电穿孔条件优化转染，使得在检测条件下转染效果较佳。
Ambion 开发了多种转染试剂，用于将 siRNA 高效转移至特定细胞类型；有关更多信息，请参见 siPORT™ siRNA 电穿孔缓冲液。
筛选靶向数百个基因的 siRNA 需要适用于高通量转染的条件。siPORT™ NeoFX™ 有助于在不到一个小时的时间里转染多达 1,000 个孔而无需自动化设备。
(3) 筛选
优化检测和转染过程后，可将 siRNA 文库依次导入 24 或 96 孔板中的细胞中。每种 siRNA 进行三次平行转染可为合理的统计分析提供足够的数据。在每个平板上转染的阳性和阴性对照 siRNA 可提供定量数量，使用这些数量可将来自不同平板的数据归一化，并将提供可用于鉴定评级为"命中"的基因的表型范围。
阳性和阴性对照 siRNA 均可从 Ambion 获得。
(4) 验证命中
"命中"是 siRNA 产生的表型与阳性对照相似的基因。验证命中涉及到结果表明观察到的表型是靶基因表达减少所致。我们通过以下方法确认命中：单独转染靶向相同基因的三种不同 siRNA，监测靶 mRNA 或蛋白减少情况，然后测量表型。理论上，所有使靶基因表达出现相似程度减少的 siRNA 应产生相同的表型。在实践中，我们发现 siRNA 的偶然脱靶序列效应可导致给定 siRNA 的假阳性或假阴性表型。使用三种单独 siRNA 可基本消除假阳性和假阴性。
测量细胞表型强度的检测包括监测细胞大小、细胞周期状态或抗体染色的显微镜检测；用于评估细胞裂解物中特定底物的转化情况的酶促试验；直接测量裂解物、细胞或培养基中的生物分子或小分子。
成功的筛选必须使用可定量测定细胞表型并尽可能提高信噪比的检测。高效检测必须包括高质量阳性和阴性对照 siRNA。将阳性对照 siRNA 转染至细胞中时，其应产生所需表型，理想情况下阳性对照 siRNA 的靶标应为已知在所研究的过程中发挥作用的基因。例如，如果目标是鉴定由特定分子刺激后信号转导通路涉及的基因，则转染靶向分子受体的 siRNA 应破坏细胞信号转导并产生所需表型。同样，阴性对照 siRNA 对检测结果应基本无影响，其应与未转染或模拟转染细胞相当。
尽可能提高信噪比涉及检测变量，如检测时间、检测组分（即报告基因）、细胞类型和转染与检测之间的时长。阳性对照与阴性对照之间的检测结果差异越大，筛选结果覆盖面越大，因此，鉴定出感兴趣基因的机会越高。
(2) 针对所需细胞优化转染条件。
第一步是确定转染试剂和铺板条件，尽可能增加活性 siRNA 的摄取，同时保持高细胞活力。我们发现，在使用 2-5 种不同转染试剂进行转染（当使用细胞系时）或者以 5-10 种电穿孔条件（例如，改变细胞浓度、电压、脉冲长度、脉冲数、siRNA 浓度等）进行转染（当使用原代或悬浮细胞时）的细胞中测量敲低情况和细胞活力很有用。然后可针对试剂或电穿孔条件优化转染，使得在检测条件下转染效果较佳。
Ambion 开发了多种转染试剂，用于将 siRNA 高效转移至特定细胞类型；有关更多信息，请参见 siPORT™ siRNA 电穿孔缓冲液。
筛选靶向数百个基因的 siRNA 需要适用于高通量转染的条件。siPORT™ NeoFX™ 有助于在不到一个小时的时间里转染多达 1,000 个孔而无需自动化设备。
(3) 筛选
优化检测和转染过程后，可将 siRNA 文库依次导入 24 或 96 孔板中的细胞中。每种 siRNA 进行三次平行转染可为合理的统计分析提供足够的数据。在每个平板上转染的阳性和阴性对照 siRNA 可提供定量数量，使用这些数量可将来自不同平板的数据归一化，并将提供可用于鉴定评级为"命中"的基因的表型范围。
阳性和阴性对照 siRNA 均可从 Ambion 获得。
(4) 验证命中
"命中"是 siRNA 产生的表型与阳性对照相似的基因。验证命中涉及到结果表明观察到的表型是靶基因表达减少所致。我们通过以下方法确认命中：单独转染靶向相同基因的三种不同 siRNA，监测靶 mRNA 或蛋白减少情况，然后测量表型。理论上，所有使靶基因表达出现相似程度减少的 siRNA 应产生相同的表型。在实践中，我们发现 siRNA 的偶然脱靶序列效应可导致给定 siRNA 的假阳性或假阴性表型。使用三种单独 siRNA 可基本消除假阳性和假阴性。