实时、定量 RT-PCR (qRT-PCR) 是检测和定量测定 mRNA 的较灵敏方法，常用于验证监测基因表达变化的技术，包括阵列分析和 RNA 干扰实验。Cells-to-Signal™ 试剂盒（正在申请专利）是一种能够从少至三个细胞处理样本以进行 qRT-PCR 的快速方法。使用 Cells-to-Signal 试剂盒制备的裂解物与采用 TaqMan 或 SYBR Green 检测方法的 qRT-PCR 兼容。
RNA 干扰 (RNAi) 已成为理解基因功能的重要工具。研究人员越来越依赖 qRT-PCR 检测和定量测定 mRNA 水平，以证实 siRNA 对基因表达的敲低。Ambion 的 Cells-to-Signal 试剂盒通过绕过 RNA 分离和 DNA 去除步骤极大简化了该程序（图 1）。当 PCR 引物被设计为跨越外显子-外显子边界时，使用 Cells-to-Signal 试剂盒制备的细胞裂解物可直接用于 qRT-PCR。在此，我们证明 Cells-to-Signal 裂解物与 TaqMan 探针和 SYBR Green 检测方法兼容。


图 1.Cells-to-Signal™ 程序。经过约 5 分钟的细胞裂解程序后，裂解物可直接用于 RT-PCR，只要引物对跨越外显子-外显子边界即可。此外，还应包括 Minus 逆转录酶对照反应，以监测基因组序列的潜在扩增。TaqMan 探针的序列特异性允许进行一步法或两步法 RT-PCR，而与任何双链 DNA 分子结合的 SYBR Green 检测方法需要两步法 RT-PCR 以减少非特异性背景。

使用 TaqMan 探针的 qRT-PCR

TaqMan 探针是与 PCR 产物内部区域同源的短链寡核苷酸，用 5' 荧光基团和 3' 淬灭剂标记。PCR 扩增的定量测定依靠 Taq 聚合酶的 5' 核酸外切酶活性来降解探针并将荧光基团与淬灭剂分离。

Cells-to-Signal 裂解物是使用 TaqMan 探针进行一步法 qRT-PCR 的理想选择。如图 2 所示，用靶向 GAPDH 的 30 nM siRNA 或 30 nM 阴性对照 siRNA 转染 HeLa 细胞。转染后 48 小时，使用 Cells-to-Signal 试剂盒制备细胞裂解物，用于使用 TaqMan 引物和探针集进行的 qRT-PCR。与阴性对照 siRNA 相比，GAPDH 特异性 siRNA 敲低 GAPDH 基因表达超过 80%。


图 2.使用 TaqMan 引物和探针集测定 siRNA 诱导的基因表达敲低。将 HeLa 细胞铺到 24 孔板中（3 x 104 个细胞/孔）。用 30 nM Silencer 阴性对照 #1 siRNA (Ambion) 或 Silencer GAPDH siRNA (Ambion) 转染细胞。48 小时后，收获细胞并用 Cells-to-Signal™ 试剂盒 (Ambion) 裂解（最终体积 = 500 µL）。在一步法 RT-PCR（在 ABI Prism 7900HT 序列检测系统 (Applied Biosystems) 上使用 TaqMan 引物和探针集）中使用 3 µL 细胞裂解物。使用 18S rRNA 作为内部对照对 GAPDH 信号进行归一化。Ct 值参见插图表。

采用 SYBR Green 检测方法的 qRT-PCR

SYBR Green 是一种可与双链 DNA 结合的经济型核酸染色剂，可用于在大多数实时检测平台上检测 PCR 产物。尽管该方法通常比使用标记探针的技术需要更多的优化，但 SYBR Green 可与 Cells-to-Signal 裂解物和两步法 qRT-PCR 兼容。

为确保分析准确，PCR 后应评估产物解离曲线。例如，用靶向 GAPDH 的 30 nM siRNA 或阴性对照 siRNA 转染 HeLa 细胞。转染后 72 小时，使用 Cells-to-Signal 试剂盒制备细胞裂解物，用于 qRT-PCR。与预期一致，相对于用阴性对照转染的细胞，GAPDH 的表达水平降低了 80% 以上（图 3）。为了证明扩增曲线中 SYBR Green 的相对荧光是与特定 PCR 产物相互作用的结果，绘制了各产物的解离曲线（图 3，插图）。预期 Tm 处的定义峰指示来自 Cells-to-Signal 裂解物的特异性 GAPDH 和 18S rRNA 扩增。


图 3.采用 SYBR Green 测定 siRNA 诱导的基因表达敲低。将 HeLa 细胞铺到 96 孔板中（8 x 103 个细胞/孔）。用 30 nM Silencer 阴性对照 #1 siRNA (Ambion) 或 Silencer GAPDH siRNA (Ambion) 转染细胞。72 小时后，收获细胞并用 Cells-to-Signal™ 试剂盒 (Ambion) 裂解（最终体积 = 100 µL）。在两步法 RT-PCR（在 ABI Prism 7900HT 序列检测系统 (Applied Biosystems) 上使用 SYBR Green）中使用 3 µL 细胞裂解物。使用 18S rRNA 作为内部对照对 GAPDH 信号进行归一化。这些扩增曲线显示了来自阴性对照 siRNA 转染细胞和来自 GAPDH siRNA 转染细胞的 18S rRNA 和 GAPDH 的相对荧光和 Ct 值。对于四份转染重复样本，GAPDH 的表达敲低百分比为 80% ± 4.3%。（插图）各样本的解离曲线表明，所需目标扩增子是 PCR 的主要产物。

细胞裂解和 cDNA 合成

Ambion 的 Cells-to-Signal 试剂盒专门用于通过实时 RT-PCR 对细胞中的基因表达进行定量测定，适用于监测 siRNA 诱导的敲低。Cells-to-Signal 裂解物与一步法或两步法 RT-PCR 及 TaqMan 探针和 SYBR Green 检测技术兼容。Cells-to-Signal 试剂盒含有用于细胞裂解和逆转录的试剂，包括 M-MLV RT、Oligo(dT)18 引物和随机十聚体引物。每次反应可使用的样本量最多为 5 x 104 个细胞。该试剂盒还包含用于监测 RT-PCR 抑制的对照 RNA 以及用于优化逆转录效率的互补引物。

科学参与人员
Jennifer Ho, Kevin Kelnar, Quoc Hoang, Rich Jarvis • Ambion, Inc.