生产 siRNA 的五种方法

许多研究人员现在使用小干扰 RNA (siRNA) 来减少特定哺乳动物基因的表达。在本文中，我们描述了五种生产用于哺乳动物 RNAi 实验的 siRNA 的方法。每种方法都有其优点和缺点。生成 siRNA 的合适方法取决于实验的目标。本文简要介绍了五种方法，介绍了它们的优点和缺点，并讨论了它们适合的应用类型。

目前，有五种方法可用于生成进行基因沉默研究的 siRNA：

1. 化学合成
2. 体外转录
3. 使用 RNase III 家族酶（例如 Dicer、RNase III）对长链 dsRNA 进行消化
4. siRNA 表达质粒或病毒载体细胞中的表达
5. PCR 来源 siRNA 表达盒细胞中的表达

前三种方法涉及 siRNA 的体外制备，然后通过脂质转染法、电穿孔或其他技术直接引入哺乳动物细胞。最后两种方法均依赖于在细胞中引入表达 siRNA 的基于 DNA 的载体和表达盒。下表 1 总结了这些方法。

*取决于选择的纯化/脱保护选项和形式（例如，退火且可随时转染 vs 冻干提供的单链）

方法 1：化学合成
该方法尽管比其他任何方法都更昂贵，但研究人员几乎无需费力即可生产化学合成 siRNA。我们和其他几家公司可提供高质量的定制化学合成 siRNA。化学合成的主要优点之一是可产出大量高纯度 siRNA。该方法的缺点包括价格和周转时间（通常为 4-12 天，具体取决于合成和纯化选项）。由于价格相对较高，许多研究人员发现，一种有利的方式是使用更便宜的制备方法（如体外转录）筛选 siRNA 序列，然后高效化学合成序列。Ambion 提供了一种稳健的设计算法，可获得较高比例的高效 siRNA 序列。改进的 siRNA 设计标准减少了需要检测的序列数量，降低了与该选项相关的成本。

适用于：
需要大量定义超纯 siRNA 序列的研究

不适用于：
长期研究

Ambion 的解决方案：定制、预设计和经验证的 siRNA
定制 siRNA：我们为您选择的合成选项提供高质量的定制 siRNA。我们的标准纯化程序包括脱保护和色谱柱纯化，通常可获得纯度为 90%（保证纯度 >80%）的 siRNA。还可选择 HPLC 和 PAGE 纯化，可产出保证纯度 >97% 的 siRNA。所有的 RNA 寡核苷酸都通过 MALDI-TOF（基质辅助激光解吸-电离-飞行时间）质谱进行评估，退火 siRNA 通过非变性凝胶或毛细管电泳进行分析，以确认链正确退火。

预设计 siRNA：Ambion 的合作伙伴 Cenix BioScience 开发的设计算法，以令人印象深刻的成功率预测强效和特定 siRNA 序列。多种 siRNA 设计适用于由 NCBI 维护的公共 RefSeq 数据库中列示的所有人、小鼠和大鼠基因。我们还可以利用该算法来设计非 RefSeq 数据库内的其他生物体或基因的 siRNA。

经验证的 siRNA：Silencer™ 经验证 siRNA 是经过实验验证的单一 siRNA 双链体，可减少单个人类基因的表达。通过实时 RT-PCR 证明，在转染后 48 小时，各 siRNA 能够使靶基因表达降低至少 70%。观察到大部分 siRNA 可使靶基因表达降低 90% 或更多。每一条 Silencer 经验证 siRNA 链均通过 HPLC 法进行纯化，并进行严格的质量控制措施。其结果是得到具有经确认可减少基因表达的序列的高质量 siRNA。


方法 2：体外转录
siRNA 容易通过体外转录制备。通过该方法生产的 siRNA 的成本明显低于其化学合成对应物的成本，这使其成为筛选 siRNA 序列更具成本效益的选择。此外，它们的生产速度比化学合成 siRNA 更快。一旦获得模板脱氧核苷酸，该程序大约需要 24 小时，并且手动操作时间极少。该方法的缺点包括可进行规模扩大的可能性有限（尽管各反应均可产生用于数百次转染的足够 siRNA）以及以下事实：与可以简单购买的化学合成 siRNA 相比，该方法需要研究人员花费更多的手动操作时间。应注意的是，体外转录 siRNA 和化学合成 siRNA 同样有效，且通常浓度较低——0.5-20 nM vs. 50-100 nM 浓度/转染（图 1）。

适用于：
筛选 siRNA 序列或化学 siRNA 合成的价格是障碍的情况

不适用于：
长期研究或需要大量单一 siRNA 序列的研究

解决方案：Silencer™ siRNA 构建试剂盒
Silencer siRNA 构建试剂盒能以化学合成几分之一的成本产生转染即用型 siRNA。本试剂盒提供了一种正在申请专利的体外转录方法，可在 24 小时内生成多达 15 条纯化 siRNA。使用 Silencer siRNA 构建试剂盒可节省您的成本和时间，帮助您筛选更多基因以及更多靶基因内潜在靶标的序列，以便找到强效 siRNA。

图 1.使用化学合成和体外转录 siRNA 诱导基因沉默。使用Silencer siRNA 构建试剂盒通过化学合成或体外转录制备靶向 ß 肌动蛋白的 siRNA。将 HeLa 细胞以 30,000 个细胞/孔的浓度铺板到含有载玻片的 24 孔组织培养板中。铺板后 24 小时，根据生产商的方案，使用 2 µL siPORT™ 脂质 (status:302) 转染细胞，使得最终 siRNA 浓度为 75 nM。转染后 96 h 使用小鼠抗人 ß 肌动蛋白一抗和 FITC 结合抗小鼠 IgG 二抗进行免疫荧光分析。使用适当的荧光滤光片拍摄照片并使用 MetaMorph 软件进行定量分析。请注意，两种 siRNA 制备方法均使 ß 肌动蛋白的蛋白水平降低 > 95%。

方法 3：长链 dsRNA 消化以形成 siRNA 混合物
所有其他 siRNA 生产方法的主要缺点之一是需要设计和检测几种 siRNA 序列，然后才能确定有效的 siRNA 序列。siRNA 混合物的制备克服了这一限制。在该方法中，使用通常编码靶 mRNA 的 200-1000 nt 区域的模板进行体外转录，从而制备长链 dsRNA。随后，使用 RNase III（或 Dicer）体外消化 dsRNA，并产生 siRNA 细胞群或混合物。由于该混合物含有许多不同的 siRNA，因此实际上可以保证高效的基因敲低。图 2 描述了其中一种实验的代表性实验。
该方法的主要优点是能够绕过选择高效 siRNA 序列所需的检测步骤，为研究人员节省时间和资金（注意，RNase III 反应通常比使用 Dicer 更便宜）。然而，这种方法的一个缺点是理论上存在的非特异性沉默效应，特别是对于密切相关的基因而言更是如此。迄今为止的多数研究表明，这并不构成问题 (1-4)。

适用于：
快速且价格便宜地分析功能表型的丧失

不适用于：
长期研究或需要单一、定义 siRNA 序列的研究

解决方案：Silencer™ siRNA 混合物试剂盒 (RNase III)
使用 Silencer siRNA 混合物试剂盒 (RNase III)，可通过快速、简单的程序制备特定靶标的 siRNA 细胞群。Silencer siRNA 混合物试剂盒 (RNase III) 产生的 siRNA 细胞群可引发与精心设计的单一 siRNA 相当的基因沉默效应，而无需设计和筛选单一 siRNA。科学家已经检测过多个基因，尚未观察到细胞毒性的增加。与靶向相同基因的单一化学合成 siRNA 相比，也尚未观察到任何与使用 siRNA 细胞群相关的非特异性效应。迄今为止，科学家已将该试剂盒成功与 NIH-3T3、HeLa、S3、293 和 BJ 细胞系结合使用，并敲低许多基因（包括 c-fos、GAPDH、La、ß 肌动蛋白和 Ku-70）的表达。

图 2.使用 Silencer siRNA 混合物试剂盒进行基因沉默。使用 Silencer siRNA 混合物试剂盒 (RNase III) 制备靶向 200 nt Ku-70 mRNA 的 siRNA 细胞群，并以 100 nM 最终浓度转染到 HeLa 细胞中。48 小时后通过免疫荧光法分析细胞。与非转染对照相比，使用 siRNA 混合物转染的细胞中 Ku-70 水平降低了 86%。

迄今为止描述的所有方法均依赖于 siRNA 的体外制备。然而，siRNA 表达载体和基于 PCR 的表达盒的使用依赖于引入细胞的 DNA 模板中 siRNA 的体内转录。这两种方法的一个优势是无需直接处理 RNA。

方法 4：siRNA 表达载体
大多数 siRNA 表达载体均依赖于 RNA 聚合酶 III (pol III) 启动子来驱动哺乳动物细胞 (1-4) 中小发夹 siRNA 的表达。选择 RNA pol III 来驱动 siRNA 表达，因为它天然表达哺乳动物细胞中相对大量的小 RNA，它在合并了一串 1-4 个尿苷时终止转录，并且其转录本缺乏多聚腺苷酸尾。

要使用 siRNA 表达载体，订购两个寡脱氧核苷酸（编码所需的短发夹 RNA 序列），然后退火并克隆到启动子下游的载体中。由于涉及克隆，该程序需要数天来完成，并且需要对包含插入片段的区域进行测序。然而，一旦显示载体在基因沉默实验中效果良好，则这种限制被产生大量载体的能力所平衡。

毫无疑问，siRNA 表达载体的主要优势是它们适用于长期研究具有抗生素抗性标记物的载体可用于在几周或更长时间内减少靶向基因的表达。瞬时选择使用含有质粒的选择标记转染的细胞还可富集已摄取质粒的细胞。这有助于补偿难转染细胞的低转染效率。最近，一些组织（包括 Ambion）已经开始制备腺病毒、逆转录病毒和其他用于 siRNA 表达的病毒载体（请参见 pSilencer 腺病毒 1.0-CMV）。这些载体提供了可以转导细胞以进行基因沉默研究的额外优势，从而减少了与低效质粒转染相关的问题。

适用于：
需要进行长期及其他研究，以便对含有细胞的 siRNA 进行抗生素选择。逆转录病毒可高效整合 siRNA 表达盒。

不适用于：
筛选 siRNA 序列（注意：可以筛选 siRNA 序列，但使用载体耗时且费力）。

解决方案：pSilencer ™ siRNA 表达载体
pSilencer siRNA 质粒表达载体具有 U6 和 H1 pol III 启动子、氨苄青霉素抗性基因；大肠杆菌复制起始点；以及三种抗生素选择标记（新霉素、嘌呤霉素或湿度霉素抗性基因）之一。将 siRNA 模板克隆到载体中，从而在质粒递送至细胞后获得 siRNA 表达。

还可选择 pSilencer 腺病毒 siRNA 表达载体，从而可在其他难以转染的细胞中更容易地递送表达载体。

图 3.使用 pSilencer 2.1-U6 hygro 长期沉默 GFP。使用含有插入片段（编码靶向周期 3 GFP 的 siRNA）的 pSilencer 2.1-U6 hygro 或不含 siRNA 编码插入片段的 pSilencer 2.1-U6 hygro 转染表达周期 3 GFP 的 HeLa 细胞。转染后，用潮霉素选择细胞。选择后三周，通过荧光显微镜检查对细胞的 GFP 表达进行分析。 绿色：GFP。 蓝色：DAPI 染色细胞核。与采用“空”siRNA 表达载体转染的细胞相比，采用 GFP siRNA 编码 pSilencer 2.1 U6 hygro siRNA 表达载体转染的细胞中 GFP 水平显著降低 (94%)。

方法 5：siRNA 表达盒
siRNA 表达盒 (SEC) 是来源于 PCR 的 siRNA 表达模板，可直接引入细胞，而且无需先克隆到载体中。根据 Castanotto 及其同事 (5) 最初的描述，SEC 包括 RNA pol III 启动子、编码 siRNA 发夹结构的序列以及 RNA pol III 终止位点。与 siRNA 表达载体（在使用之前需要进行克隆和测序，因此需要 1-2 周才能制备）不同，SEC 可在不到一天的时间内通过 PCR 来生成。因此，SEC 可提供一个出色的筛选工具，以便找到高效的 siRNA 序列或者鉴定指定细胞系中启动子和 siRNA 的高效组合。事实上，SEC 是对 siRNA 表达载体的出色补充。通过在末端合并限制性位点，可高效诱导基因沉默的 SEC 可以很容易地克隆到质粒或病毒载体中，从而形成 siRNA 表达载体。然后，siRNA 表达载体可用于稳定表达和长期研究。SEC 的缺点之一是，其不像 siRNA 那样容易转染到细胞中。不过，随着新的转染试剂和方案的开发，SEC 的转染效率也会提高。由于 SEC 是由 PCR 生成的，因此如果不克隆到质粒中，SEC 无法进行规模扩大。图 3 显示了从实验获取的数据，其中对各包含三个不同启动子之一的 SEC 进行检测，以确定其驱动 siRNA 表达并诱导 c-fos 表达敲低的能力。

适用于：
制备载体前筛选 siRNA 序列和检测启动子

不适用于：
长期研究，直到克隆到含有选择标记的载体中

图 4.使用具有不同启动子的 SEC 来差异性降低靶基因表达。将具有小鼠 U6 (Mo U6)、人 U6 (Hu-U6) 和人 H1 (Hu-H1) 启动子和编码 c-fos 特异性发夹 siRNA 的 siRNA 表达盒转染至 HeLa 细胞。转染后 72 小时，使用含 DAPI 的细胞核染色剂和使用 c-FOS 抗体的免疫荧光对细胞进行评估。未转染细胞 (NT) 以及使用表达阴性对照 siRNA（加扰）的 SEC 转染的细胞显示存在野生型 c-FOS。定量分析了基因表达的相对降低水平，并在条形图中提供结果。