在该研究中，使用靶标 siRNA 改变存活素表达，并对转染细胞进行了一系列生化和基于细胞的检测，以评估已知的细胞凋亡指标，从而更好地理解存活素在癌症中的作用。首先使用 TaqMan 基因表达检测试剂盒 (Applied Biosystems) 评估了 Silencer 靶向存活素的预设计 siRNA (Ambion) 的沉默情况。然后使用经验证的 siRNA 研究存活素下调在 HeLa 细胞中的功能效应。通过监测以下项评估细胞凋亡：a) 细胞存活/增殖，b) 核凝集和染色体片段化，c) 磷脂酰丝氨酸外化，d) 半胱天冬酶活化。使用时程研究证实，诱导的生物效应的量级与 siRNA 在 mRNA 和蛋白水平上诱导的沉默的量级相关。总之，数据表明，尽管存活素蛋白水平降低未能激活 pro-caspase-3，但其可诱导细胞凋亡相关事件。

介绍

存活素 (BIRC5) 是一种 17 kDa 双功能蛋白质，在细胞分裂和存活调节中发挥着关键作用 [1]。存活素表达与多种癌症有关 [2]；所有主要癌症类型均表达存活素，而存活素在非癌变分化细胞中不表达 [3]。

在许多细胞类型中，存活素通过抑制半胱氨酸蛋白酶家族的成员（如半胱天冬酶-9 [4]、半胱天冬酶-3 和半胱天冬酶-7 [5]）来阻断细胞凋亡。研究人员认为，存活素通过细胞周期蛋白依赖性激酶 cdc2 在 Thr 34 处的磷酸化可促进存活素与半胱天冬酶-9 之间的物理相互作用，从而抑制半胱天冬酶-9 [6]。有趣的是，存活素与 cdc2 蛋白在有丝分裂纺锤体处共迁移，两者均对细胞周期的正确进展至关重要 [7]。存活素与其他“细胞凋亡抑制剂”(IAP) 蛋白一样，包含一个 BIR（杆状病毒 IAP 重复）结构域，此结构域可促进与半胱天冬酶以及 HBXIP（乙型肝炎 X 相互作用蛋白，它是存活素的一种拟定辅因子）的结合 [1]。

基于其表达模式以及在阻断细胞凋亡过程中观察到的作用，可以推断存活素复合物及其成分对癌细胞存活和凋亡控制非常重要。尽管有这些观察结果，但尚不清楚存活素过表达促进肿瘤形成的确切机制。

siRNA 检测

实验设计。通过监测接受多种浓度的 siRNA 的细胞中的存活素 mRNA 水平，检测了靶向存活素的三种不同 Silencer siRNA 的有效性和效力。使用 siPORT™ NeoFX™ 转染试剂 (Ambion) 以多种浓度（范围为 0.05 – 100 nM）将各 siRNA 反向转染 [8] 至 HeLa 细胞中，一式三份。此前已使用 siPORT NeoFX 转染试剂针对 HeLa 细胞的反向转染确立了最合适的转染条件 [9]。

转染后 48 小时，使用 TaqMan 基因表达检测试剂盒 (Applied Biosystems) 对比监测了由 siRNA 引起的存活素 mRNA 下调与用非靶向阴性对照 siRNA（ Silencer 阴性对照 #1 siRNA；Ambion）处理的细胞中的存活素 mRNA 下调。

结果。检测的所有三种 siRNA 均产生了强效沉默。例如，在 siRNA 浓度仅为 1 nM 时，所有三种 siRNA 均显示 > 85% 存活素 mRNA 沉默（图 1）。然而，在极低 siRNA 浓度下，IC50 值（使靶标 mRNA 降低 50% 的浓度，或抑制浓度）突出显示了这三种 siRNA 分子之间的差异。为该研究选择了其中两种 siRNA，即 #2646 和 #121294。要确认观察到的表型结果是预期基因沉默所致，而不是 siRNA 序列依赖性脱靶效应所致，需要使用至少两种 siRNA 而非一种经验证的 siRNA。在我们的案例中，我们特意选择了可提供不同沉默效率的两种 siRNA：#121294 的 IC50 至少是 #2646 的 10 倍。本研究中包含了效率较低的 siRNA #121294，以比较提供不同水平存活素沉默的 siRNA 的表型结果。


图 1.靶向存活素的 siRNA 的验证。以 5 种浓度使用 0.3 µL siPORT™ NeoFX™ 转染试剂（Ambion，货号 AM4510）将三种靶向人存活素的 Silencer 预设计 siRNA 和非靶向 Silencer 阴性对照 #1 siRNA（Ambion，货号 AM4624）反向转染至 HeLa 细胞中，一式三份。转染后 48 小时，使用 MagMAX™-96 总 RNA 分离试剂盒（Ambion，货号 AM1830）分离 RNA。cDNA 使用 MMLV 逆转录酶（Ambion，货号 AM2043）合成，使用 2 µL cDNA 以及存活素 Hs00977611_g1 TaqMan 基因表达检测试剂盒 (Applied Biosystems) 在实时 RT-PCR 反应中扩增存活素 mRNA。其余的基因表达百分比表示为存活素 mRNA 在用存活素 siRNA 转染的培养物中的含量相对于在用非靶向对照 siRNA 转染的细胞中的含量。利用针对 18S rRNA 的 TaqMan 基因表达检测试剂盒对总 RNA 浓度的差异进行归一化。

将沉默与生物效应相关联

使用靶向 siRNA 进行细胞转染后的表型变化是随着时间发生的多步骤过程的结果。siRNA 降低 mRNA 水平导致靶蛋白随后降低。蛋白浓度最终会达到足以引发表型变化的阈值。因此，有必要确定靶标 mRNA 及后续蛋白降低的时程，并将其与观察到的表型效应相关联。

沉默时程方法

实验设计。为将生物效应与沉默结合，务必要在沉默效果最大的时间范围内进行这些检测。我们将存活素和非靶向 siRNA 递送至细胞中并在转染后 24、48、72、96 和 120 小时这些时间点测定 mRNA 和蛋白水平，借此来确定存活素 mRNA 和蛋白沉默的时段。mRNA 水平则使用 qRT-PCR 以及与图 1 中用于验证 siRNA 诱导沉默的 Applied Biosystems TaqMan 基因表达检测试剂盒相同的产品进行监测（图 2）。对于存活素蛋白分析，收获细胞并进行裂解，使用 SDS-PAGE 分离蛋白，然后转印至 PVDF 膜，并使用 Applied Biosystems Western-Light™ 免疫检测系统进行 Western 印迹分析（图 3）。Western-Light 系统提供了一种灵敏、基于化学发光的蛋白检测方法。

结果。与非靶向阴性对照转染细胞相比，将存活素 siRNA 转染至 HeLa 细胞中使存活素 mRNA 降幅大于 80%。然而，沉默的模式并不相同。在本研究的时程中，存活素 siRNA #2646 持续将存活素 mRNA 敲低超过 80%，而存活素 siRNA #121294 在最初 48 小时内有效敲低了存活素 mRNA，至转染后 96 小时存活素 mRNA 水平升高至 50% 的表达水平（图 2）。存活素蛋白的表达模式与存活素 mRNA 的表达模式相似（图 3），表明存活素 mRNA 和蛋白的表达是由 siRNA 决定的敲低特征。


图 2.用存活素 siRNA 转染的 HeLa 细胞中存活素 mRNA 降低的时程。在 96 孔板（4000 个细胞/孔）中使用 siPORT™ NeoFX™ 转染试剂 (0.3 µL; Ambion) 将两种 Silencer siRNA [siRNA #2646 (A) 和 #121294 (B)] 转染至 HeLa 细胞中，一式三份 (30 nM siRNA)。在指定时间（X 轴）裂解细胞，随后使用 MagMAX™-96 总 RNA 分离试剂盒（Ambion，货号 AM1830）从各样本中分离总 RNA。使用存活素 Hs00977611_g1TaqMan 基因表达试剂盒测量存活素 mRNA 水平。其余的基因表达百分比表示为存活素 mRNA 在用存活素 siRNA 转染的培养物中的含量相对于在用 Silencer 阴性对照 #1 siRNA（Ambion，货号 AM4635）siRNA 转染的细胞中的含量。利用针对 18S rRNA 亚单元的 TaqMan 基因表达检测试剂盒作为总 RNA 上样液的对照品。



图 3.用存活素 siRNA 转染的 HeLa 细胞中存活素蛋白降低的时程。在 6 孔板（2.5x105 个细胞/孔）中使用 siPORT™ NeoFX™ 转染试剂（5 µL；Ambion 货号 AM4510）将两种独特的 Silencer siRNA [siRNA #2646 (A) 和 #121294 (B)] 转染至 HeLa 细胞中，一式三份 (30 nM siRNA)。在指定时间收获细胞并进行裂解。通过 SDS-PAGE 分离蛋白裂解液（40 µg 蛋白），然后转印至膜上。使用兔抗存活素多克隆抗体（稀释度 1:2000；Abcam 货号 AB469）免疫印迹法和 Western-Light™ 免疫检测系统（Applied Biosystems 货号 T1047）检测存活素蛋白。检测 GAPDH，用作上样对照品（Ambion 货号 AM4300）。NT = 非转染；NC = Silencer 阴性对照 siRNA #1（Ambion 货号 AM4611）。

测量细胞凋亡的方法

实验设计。在上述时程中，进行了一系列生化和形态学检测，以衡量 siRNA 介导的存活素沉默对几种凋亡指标的影响。转染后在不同时间点收获用存活素 siRNA #2646 和 #121294 转染的细胞，并进行以下评估：

  • 细胞存活。细胞凋亡最终导致细胞死亡。使用二乙酸荧光素（FDA；一种荧光非特异性酯酶底物）测量相对细胞存活率。
  • 核凝集。染色质凝集是一种晚期细胞凋亡指示指标，在细胞 DAPI 染色后通过荧光显微镜检查进行监测。
  • 磷脂酰丝氨酸外化增加。通过磷脂酰丝氨酸外化证实的膜不对称性诱导是一种早期细胞凋亡指示指标，测量方法为通过荧光膜联蛋白 V 标记，然后使用 8200 细胞检测系统（Applied Biosystems，货号 4342920）进行检测。
  • Pro-caspase-3 活化。半胱天冬酶-3 活化是早期到中期细胞凋亡指示指标，使用荧光半胱天冬酶-3 底物进行检测。

细胞存活结果。存活素支持细胞增殖，因此，预计存活素沉默可能会导致细胞数量减少。与未转染细胞相比，两种存活素 siRNA 在监测的任何时间点均未导致细胞数量显著减少（图 4）。


图 4.siRNA 引起的存活素沉默对细胞数量的影响。使用 siPORT™ NeoFX™ 转染试剂（0.3 µL；Ambion 货号 AM4510）将 Silencer siRNA #2646 和 #121294 转染至 HeLa 细胞（96 孔板中 4000 个细胞/孔）中，一式三份 (30 nM siRNA)。在转染后的不同时间点，收获细胞并在 4°C 下于 125 µL 冷细胞裂解缓冲液（50 mM Na-HEPES pH 值 7.4、40 mM NaCl、0.5% NP-40、0.5 mM EDTA）中裂解 20 分钟。将细胞提取物 (8 µL) 添加至含有 32 µL 底物溶液（含 0.01 mg/mL 二乙酸荧光素的 40 mM TrisCl（pH 值 7.5）、20 mM NaCl、5% 乙腈）的 384 孔板孔中。相对细胞数/孔通过测量室温下 4 分钟内的荧光 (ex = 488 nm, em = 529 nm) 增加来确定。


细胞核形态学结果。已证明存活素的特异性沉默可引起凋亡事件，其中一种是核凝集引起的核形态特征变化。因此，通过用 DAPI 进行细胞染色，在转染后 48-72 小时观察核形态学。在用各存活素特异性 siRNA 转染的 HeLa 细胞中观察到核变化。48 小时时，许多存活素 siRNA 转染细胞显示核凝集，而 Silencer 阴性对照 #1 siRNA 转染细胞未显示核凝集（图 5）。


图 5.存活素沉默会导致核形态发生变化。用 (A) 靶向存活素的 siRNA (30 nM) 和 (B) Silencer 阴性对照 #1 siRNA（Ambion，货号 AM4635）转染的 HeLa 细胞在转染后 48 小时固定，并用 DAPI 染色。采用 Olympus BX60 荧光显微镜对细胞核形态进行评估。


膜联蛋白 V 检测结果。细胞凋亡的最初标志之一是磷脂酰丝氨酸外化。为了解存活素沉默是否会导致磷脂酰丝氨酸外化增加，测量了荧光膜联蛋白 V 标记的细胞。膜联蛋白 V 是磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有极高亲和力，标记膜联蛋白 V 通常用于细胞凋亡检测测定。用靶向存活素的 siRNA 或非靶向阴性对照 siRNA 的转染 HeLa 细胞。转染后 72 小时，使用 8200 细胞检测系统（Applied Biosystems，货号 4342920）以均一形式检测荧光膜联蛋白 V 标记。8200 仪器可以同时对活细胞和微珠进行混合读数检测。与细胞数量一样，观察到的效应量级在两种 siRNA 之间略有变化（图 6）。


图 6.存活素沉默引起的磷脂酰丝氨酸外化。(A) 利用 siPORT™ NeoFX™ 转染试剂（0.3 µL；Ambion 货号 AM4510）使用各 30 nM 的 Silencer 靶向存活素的 siRNA #2646、#121294 和非靶向阴性对照 siRNA（阴性对照 #1 siRNA；Ambion，货号 AM4635）以 4000 个细胞/孔转染 HeLa 细胞，一式 6 份。未转染细胞 (NT) 也用作阴性对照。在转染后 5 个时间点（24、48、72、96 和 120 小时；显示 72 小时时间点）收获细胞，并使用荧光标记的膜联蛋白 V（蓝色）和 CentriRed DNA 结合染料（粉红色）测定细胞的磷脂酰丝氨酸外化情况，以计数细胞。在 Applied Biosystems 8200 细胞检测系统上扫描细胞，并使用 8200 系统软件报告各孔的膜联蛋白 V 阳性细胞百分比。(B) 用非靶向阴性对照 siRNA 和 Silencer siRNA #2646 转染的细胞图像。


半胱天冬酶-3 活化结果。一系列半胱天冬酶通常在细胞凋亡的早期阶段被活化。这些蛋白酶可切割关键的结构和核蛋白，从而导致染色体切割和核凝集。半胱天冬酶-3 通常是半胱天冬酶级联中活化的最后一种半胱天冬酶。我们监测了存活素敲低对活化半胱天冬酶-3 水平的影响。siRNA 介导的存活素沉默在 pro-caspase-3 活化检测中几乎没有影响（图 7）。我们的观察结果与已发表的报告一致，该等报告指出存活素表达抑制或沉默可引起细胞凋亡活化事件，但不诱导半胱天冬酶活化 [5, 6]。


图 7.作为细胞凋亡诱导衡量指标的半胱天冬酶活化。用 siRNA 转染细胞，如 (A) 中所示。在转染后的不同时间点，收获细胞并在 4°C 下于 125 µL 冷细胞裂解缓冲液（50 mM HEPES pH 值 7.4、40 mM NaCl、0.5% NP-40、0.5 mM EDTA）中裂解 20 分钟。混合后，向 96 孔板孔中添加 40 µL 细胞提取物，孔中含有 120 µL 底物溶液 [含 10 µM acDEVDafc 底物的半胱天冬酶缓冲液（20 mM Na-HEPES（pH 值 7.5）、1 mM EDTA、0.1% CHAPS、10% 蔗糖、5 mM DTT）]。通过测量在 30°C 下 2 小时内的荧光 (ex = 400 nm, em = 505 nm) 增加测定半胱天冬酶-3 活性，并归一化为细胞数量；y 轴 = acDEVDafc 水解/细胞数量。

讨论

在本研究中，所使用存活素 siRNA 通过评估先前与细胞凋亡通路相关的几种生物学过程来确定存活素是否在细胞凋亡中发挥作用。存活素 mRNA 和蛋白 siRNA 沉默的时程与以下项密切相关：细胞存活/增殖水平降低、核膜形状的变化以及染色体凝集和片段化、磷脂酰丝氨酸外化，这些均提示细胞凋亡。这种相关性表明，存活素的特异性沉默可诱导这些凋亡事件。siRNA 介导的存活素沉默并未产生 pro-caspase-3 活化作用（图 7），这一点与已发表的报告一致，该等报告指出存活素抑制或沉默可引起细胞凋亡活化事件，但不会导致半胱天冬酶活化 [10, 11]。未产生此活化作用表明半胱天冬酶-3 活性不是导致 HeLa 细胞凋亡的必要因素。这一结论与新出现的证据一致，表明哺乳动物细胞含有半胱天冬酶依赖性和半胱天冬酶非依赖性凋亡通路 [12]。

科学参与人员：
Lesslie Beauchamp、Diana M. Batten、Susan Magdaleno、Joe Krebs、Angie Cheng、Lance Ford • Ambion
Melissa Gee, Carol Khodier • Applied Biosystems, Bedford, MA