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RNAi 效应的荧光分析
Mike Byrom、Vince Pallotta、David Brown* 和 Lance Ford*
Ambion, Inc.
摘要
已证明使用荧光素或 Cy3 标记的 GAPDH 和 c-myc siRNA 对沉默效率没有影响，但可对转染后这些分子的分布模式进行可视化。我们使用荧光显微镜检查分析了 siRNA 定位的动态变化。我们的研究表明，大多数 GAPDH 和 c-myc siRNA 均位于细胞核外周。此外，观察到体内 siRNA 链分离，支持早期体外研究获得的相似观察结果（Zamore 等人，2000）。
使用荧光标记的 siRNA 在 mRNA 和蛋白水平上检查基因沉默的时程。GAPDH 蛋白和 mRNA 水平在转染后 4 小时中度降低，但在转染后 24 至 48 小时增强至最大水平。mRNA 和蛋白水平在转染后 10 天仍被抑制。研究人员发现，沉默效应的启动与 siRNA 从转染试剂释放到转染细胞的细胞质中以及在此期间发生的链分离密切相关。
介绍
小干扰 RNA (siRNA) 可诱导哺乳动物系统中特异性转录后基因沉默或 RNAi（Elbashir 等人，2001）。在一些非哺乳动物生物体中，认为 siRNA 扩增由 RNA 依赖性 RNA 聚合酶诱导。然而，这似乎不会发生在哺乳动物细胞中，因为针对特定基因一种剪接形式制备的 siRNA 不会使其他剪接变体沉默（Tom Tuschl，个人通信，2002 年 3 月）。在细胞内，siRNA 与 RNA 诱导沉默复合体 (RISC) 相关，该复合体通过碱基配对相互作用将小 dsRNA 引导至正确的 mRNA 靶标（Hammond 等人，2001；尼卡宁等人，2001）。siRNA 与其 mRNA 靶标相互作用后，核酸酶会裂解 mRNA（Tuschl 等人，1999；Zamore 等人，2000）
尽管 siRNA 诱导沉默仍是一种正在快速发展的新技术，但研究人员认为该技术在哺乳动物功能基因组学和作为治疗剂方面均已具有巨大前景。为了实现这一潜力，必须充分阐明其在活细胞中的作用机制。为进一步了解 siRNA 分布和代谢，需要开发追踪细胞中 siRNA 的方法。荧光标记通常用于跟踪小分子在细胞内和细胞间的移动。然而，siRNA 必须与细胞组分相互作用，尚不清楚添加大量染料是否会对 siRNA 诱导基因沉默的能力产生负面影响。我们使用 Silencer siRNA 标记试剂盒 (Ambion, Inc.) 制备荧光标记的双链 siRNA，并将已标记 siRNA 与其未标记对应物进行比较。我们证实在转染后，已标记 siRNA 仍保持完全功能并能追踪其移动。使用双标记 siRNA 追踪完整哺乳动物细胞中的 siRNA 链分离，支持先前的体外观察结果（Nykanen 等人，2001）。
尽管 siRNA 诱导沉默仍是一种正在快速发展的新技术，但研究人员认为该技术在哺乳动物功能基因组学和作为治疗剂方面均已具有巨大前景。为了实现这一潜力，必须充分阐明其在活细胞中的作用机制。为进一步了解 siRNA 分布和代谢，需要开发追踪细胞中 siRNA 的方法。荧光标记通常用于跟踪小分子在细胞内和细胞间的移动。然而，siRNA 必须与细胞组分相互作用，尚不清楚添加大量染料是否会对 siRNA 诱导基因沉默的能力产生负面影响。我们使用 Silencer siRNA 标记试剂盒 (Ambion, Inc.) 制备荧光标记的双链 siRNA，并将已标记 siRNA 与其未标记对应物进行比较。我们证实在转染后，已标记 siRNA 仍保持完全功能并能追踪其移动。使用双标记 siRNA 追踪完整哺乳动物细胞中的 siRNA 链分离，支持先前的体外观察结果（Nykanen 等人，2001）。
结果
荧光标记的 siRNA 可保留功能性。使用
Silencer siRNA 标记试剂盒将两种常用荧光标记物（Cy3 和 5 羧基荧光素 (FAM)）偶联至 siRNA，并评估对 siRNA 沉默的潜在干扰。使用靶向 c-myc 3' UTR 的 siRNA 转染细胞（Jarvis 和 Ford，2001；Demeterco 等人，2002），该 siRNA 未标记、或仅用 Cy3 标记（反义链），或使用 Cy3 标记反义链和 FAM 标记正义链的双标记。已证明下调 c-myc 可导致细胞增殖减少（Kimura 等人，1995）。在 HeLa S3 细胞中评估未标记和已标记（单链或双链）siRNA 影响细胞增殖率的能力。结果显示已标记和未标记 siRNA 等效。用已标记或未标记 c-myc siRNA 转染细胞的生长速率降低至与加扰对照 siRNA 相等的水平，其仍与未转染细胞的生长速率相当（图 1B）。为证实 siRNA 诱导的细胞增殖缺陷是由于 c-myc 沉默所致，我们使用免疫荧光显微技术检查了转染后 48 小时的蛋白表达（图 1A）。结果清楚地表明，已标记和未标记 siRNA 同样能够降低蛋白表达，而用已标记和未标记加扰对照 siRNA 转染的样本未显示沉默。
图 1.已标记 siRNA 具有功能性。如材料和方法中所述，利用 Silencer siRNA 标记试剂盒 (Ambion, Inc.) 使用 Cy3 和 FAM 在单链或双链上标记靶向 c-myc 3' UTR 的 siRNA。A. 标记后，使用 siPORT 脂质体转染试剂 (Ambion, Inc.) 将 siRNA 转染至在盖玻片上生长的 HeLa S3 细胞中。如材料和方法中所述，转染后 48 小时，使用免疫荧光分析 HeLa S3 细胞的 c-myc 蛋白表达。c-myc 蛋白以绿色显示。B. 将靶向 c-myc 的已标记或未标记 siRNA 转染至 HeLa S3 细胞中。使用单标记、双标记或未标记 siRNA 转染 HeLa S3 细胞，在转染后 72 小时，使用血细胞计数器进行计数。计算相对于未经处理的细胞群的细胞数量并绘制图表。
图 2. siRNA 沉默 GAPDH 基因表达。对于靶向人 GAPDH 的 siRNA 和加扰对照，首先利用 Ambion 的 Silencer siRNA 标记试剂盒使用 Cy3 对其进行荧光标记，然后将其转染到 HeLa S3 细胞中，再使用抗 GAPDH 抗体通过荧光显微镜检查对其进行分析。红色：Cy3 标记 siRNA；蓝色：DAPI 染色细胞核；绿色：抗 GAPDH 的荧光素标记抗体。 A. siRNA 沉默 HeLa S3 细胞中的 GAPDH 表达。 B. 加扰对照 siRNA 对 GAPDH 蛋白水平无影响。
为将这些观察结果扩展至其他基因，检测了荧光标记的 GAPDH 和 ß-肌动蛋白 siRNA（图 2），发现其与未标记的对照在沉默同源蛋白表达方面同样有效。无论在正义链和/或反义链上标记以及无论用 Cy3 或 FAM 标记，合成和体外转录的 siRNA 均具有沉默功能（数据未显示）。我们使用台盼蓝拒染试验未观察到额外的细胞死亡，因此似乎没有与荧光部分相关的细胞毒性作用（数据未显示）。
可以在细胞中追踪荧光标记 siRNA。通过用 FAM 标记正义链 RNA 并用 Cy3 标记反义链，生成靶向 c-myc 的荧光标记 siRNA。将 Cy3-FAM 双标记 siRNA 转染到细胞中，并通过荧光显微镜观察以确定其亚细胞分布模式。转染后 48 小时，通常发现 siRNA 位于核膜细胞质侧的离散焦点（图 3）。
图 3. siRNA 链分离。A. 靶向 c-myc 3' UTR 的 siRNA 的正义链和反义链分别用 FAM 和 Cy3 标记。转染后 48 小时，固定 HeLa S3 细胞，并使用 Olympus 荧光显微镜对其进行分析。这两个视图代表不同的放大倍数。箭头指向红色和绿色焦点（单个 siRNA 正义和反义链）。 B. 将用 Blackhole 淬灭剂标记正义链和用 Cy3 标记反义链的靶向 c-myc 3' UTR 的 siRNA 转染至 HeLa S3 细胞中。转染后 4、24 和 48 小时后，固定细胞，然后使用 Olympus 荧光显微镜对其进行分析。
在分裂细胞中，荧光聚焦于分裂的中线，表明 siRNA 可能在子细胞之间平均分配。虽然大多数用 Cy3 标记反义链（红色）并用 FAM 标记正义链（绿色）的转染 siRNA 出现在核膜细胞质侧的较大黄色焦点中，但也观察到少量红色和绿色信号（图 4）。分离的红色或绿色信号是来自 siRNA 单链的荧光结果。该明显链分离与先前的体外研究一致（Nykanen 等人，2001）。为证实和扩展这些观察结果，我们使用荧光共振能量转移 (FRET) 分析评估转染细胞中的 siRNA。在本实验中，用 Blackhole 淬灭剂 1 (IDT) 标记 c-myc 的正义链，并与互补的 Cy3 标记反义链杂交。在双链形式中，Cy3 信号可被 Blackhole 淬灭剂淬灭，在荧光显微镜检查期间几乎未观察到信号。将淬灭的双链 siRNA 转染到细胞中，并在转染后 4、24、48 和 72 小时检查荧光。与先前描述的双标记实验一样，在转染后 4 小时检测到少量 siRNA 荧光（可能是由于 Cy3 未完全淬灭）。在较晚的时间点，检测到信号显著增强（图 3B），表明 siRNA 正义和反义链在完整哺乳动物细胞中分离。
图 4.siRNA 的体内分布。
图 A. 使用 NBD 标记的载体阳离子脂质体将用 Cy3 标记的 siRNA 转染至在盖玻片上生长的 HeLa S3 细胞中。在指定时间，使用荧光显微镜检查分析样本中 siRNA（红色）和脂质体（绿色）的相对分布。从载体脂质体释放后，siRNA 定位于紧邻核膜的区域。
图 B. 使用用 FAM 标记正义链并用 Cy3 标记反义链的靶向 c-myc 的 siRNA 转染在载玻片上生长的 HeLa S3 细胞。转染后 48 小时，处理细胞并使用徕卡共聚焦显微镜进行分析。箭头指向正义和反义 siRNA 单链（分别由红色和绿色焦点表示）。
图 5.由 siRNA 诱导的 RNAi 的诱导和持续时间。A. 使用靶向 GAPDH 3' UTR 的 siRNA 转染 24 孔培养皿中生长的 HeLa S3 细胞。转染后 4 小时、24 小时、3、6、10 和 12 天后，收获细胞，并通过 Northern 印迹分析对·GAPDH mRNA 和 28S rRNA 水平进行分析。B. 图 A 中的 Northern 数据图，显示相对 GAPDH mRNA 水平。C. 使用靶向 GAPDH 3' UTR 的 siRNA 转染 24 孔培养皿中盖玻片上生长的 HeLa S3 细胞。转染后 4 小时、24 小时、3、6、10 和 12 天后，收获细胞，并使用免疫荧光对·GAPDH 蛋白表达进行分析。DAPI（蓝色）染色细胞核；GAPDH（绿色）的抗体与表达蛋白结合。
图 6.正在分裂的 HeLa S3 细胞中 siRNA 的分布。使用 Cy3 标记的 siRNA（红色）转染盖玻片上生长的 HeLa S3 细胞，并使用免疫荧光进行分析。通过观察染色体凝聚和细胞核分离/再形成，在盖玻片上的细胞群中检测到包含 siRNA 的分裂细胞。使用 DAPI 分析 DNA。在细胞正在分裂或似乎刚经历过分裂事件的所有情况下，siRNA 均位于细胞的中心区域。
图 7. 与分裂细胞核相关的 siRNA。使用 FAM 标记的靶向 GAPDH 的 siRNA 转染盖玻片上生长的 HeLa-S3 细胞。转染后 48 小时，收获细胞并使用 4% 多聚甲醛固定。用 VectaShield（含 DAPI）将细胞固定在显微镜载玻片上，并使用适当的荧光滤光片进行检查。可以看到 siRNA（绿色）与分裂细胞的每个细胞核（蓝色）相关。
转染 siRNA 进入离散焦点的定位产生了以下问题：siRNA 是否集中于源自转染载体的脂质体囊泡。为解决这一问题，我们使用 NBD 标记的载体脂质体（绿色）重复转染，以转染用 Cy3 标记的 siRNA（红色）。我们检查了转染后 72 小时内多个时间点的红色和绿色荧光分布。转染后只需 4 小时即可检测到少量 siRNA 从脂质体容器中“释放”，而大多数脂质体和 siRNA 共定位于细胞中的焦点内，产生黄色荧光。转染后 24 小时和 48 小时观察到“游离”siRNA 量增加（图 4）。虽然在转染后 4 小时首次检测到蛋白沉默，但我们在转染后 24 小时观察到更显著的蛋白表达抑制，在转染后 48 小时观察到最大程度的蛋白减少（图 5）。mRNA 和蛋白水平的最长沉默期与从载体脂质体中释放最多 siRNA 的时间以及链分离量增加最多的时间相关（未显示数据）。
使用靶向 GAPDH 的 siRNA 转染 HeLa S3 细胞，以检测沉默诱导和沉默持续时间。GAPDH 会使 mRNA 和蛋白水平降低，持续时间长达 10 天，在此期间细胞应经历 10-12 次倍增。该数据表明 siRNA 被传递给子细胞。如果 siRNA 未被传递到子细胞中，则含 siRNA 的细胞百分比在仅仅 2 天或 3 天内就会大幅降低。支持性免疫荧光数据显示 siRNA 集中位于分裂细胞中（图 6），似乎进入子细胞（图 7）。
图 1.已标记 siRNA 具有功能性。如材料和方法中所述，利用 Silencer siRNA 标记试剂盒 (Ambion, Inc.) 使用 Cy3 和 FAM 在单链或双链上标记靶向 c-myc 3' UTR 的 siRNA。A. 标记后，使用 siPORT 脂质体转染试剂 (Ambion, Inc.) 将 siRNA 转染至在盖玻片上生长的 HeLa S3 细胞中。如材料和方法中所述，转染后 48 小时，使用免疫荧光分析 HeLa S3 细胞的 c-myc 蛋白表达。c-myc 蛋白以绿色显示。B. 将靶向 c-myc 的已标记或未标记 siRNA 转染至 HeLa S3 细胞中。使用单标记、双标记或未标记 siRNA 转染 HeLa S3 细胞，在转染后 72 小时，使用血细胞计数器进行计数。计算相对于未经处理的细胞群的细胞数量并绘制图表。
图 2. siRNA 沉默 GAPDH 基因表达。对于靶向人 GAPDH 的 siRNA 和加扰对照，首先利用 Ambion 的 Silencer siRNA 标记试剂盒使用 Cy3 对其进行荧光标记，然后将其转染到 HeLa S3 细胞中，再使用抗 GAPDH 抗体通过荧光显微镜检查对其进行分析。红色：Cy3 标记 siRNA；蓝色：DAPI 染色细胞核；绿色：抗 GAPDH 的荧光素标记抗体。 A. siRNA 沉默 HeLa S3 细胞中的 GAPDH 表达。 B. 加扰对照 siRNA 对 GAPDH 蛋白水平无影响。
为将这些观察结果扩展至其他基因，检测了荧光标记的 GAPDH 和 ß-肌动蛋白 siRNA（图 2），发现其与未标记的对照在沉默同源蛋白表达方面同样有效。无论在正义链和/或反义链上标记以及无论用 Cy3 或 FAM 标记，合成和体外转录的 siRNA 均具有沉默功能（数据未显示）。我们使用台盼蓝拒染试验未观察到额外的细胞死亡，因此似乎没有与荧光部分相关的细胞毒性作用（数据未显示）。
可以在细胞中追踪荧光标记 siRNA。通过用 FAM 标记正义链 RNA 并用 Cy3 标记反义链，生成靶向 c-myc 的荧光标记 siRNA。将 Cy3-FAM 双标记 siRNA 转染到细胞中，并通过荧光显微镜观察以确定其亚细胞分布模式。转染后 48 小时，通常发现 siRNA 位于核膜细胞质侧的离散焦点（图 3）。
图 3. siRNA 链分离。A. 靶向 c-myc 3' UTR 的 siRNA 的正义链和反义链分别用 FAM 和 Cy3 标记。转染后 48 小时，固定 HeLa S3 细胞，并使用 Olympus 荧光显微镜对其进行分析。这两个视图代表不同的放大倍数。箭头指向红色和绿色焦点（单个 siRNA 正义和反义链）。 B. 将用 Blackhole 淬灭剂标记正义链和用 Cy3 标记反义链的靶向 c-myc 3' UTR 的 siRNA 转染至 HeLa S3 细胞中。转染后 4、24 和 48 小时后，固定细胞，然后使用 Olympus 荧光显微镜对其进行分析。
在分裂细胞中，荧光聚焦于分裂的中线，表明 siRNA 可能在子细胞之间平均分配。虽然大多数用 Cy3 标记反义链（红色）并用 FAM 标记正义链（绿色）的转染 siRNA 出现在核膜细胞质侧的较大黄色焦点中，但也观察到少量红色和绿色信号（图 4）。分离的红色或绿色信号是来自 siRNA 单链的荧光结果。该明显链分离与先前的体外研究一致（Nykanen 等人，2001）。为证实和扩展这些观察结果，我们使用荧光共振能量转移 (FRET) 分析评估转染细胞中的 siRNA。在本实验中，用 Blackhole 淬灭剂 1 (IDT) 标记 c-myc 的正义链，并与互补的 Cy3 标记反义链杂交。在双链形式中，Cy3 信号可被 Blackhole 淬灭剂淬灭，在荧光显微镜检查期间几乎未观察到信号。将淬灭的双链 siRNA 转染到细胞中，并在转染后 4、24、48 和 72 小时检查荧光。与先前描述的双标记实验一样，在转染后 4 小时检测到少量 siRNA 荧光（可能是由于 Cy3 未完全淬灭）。在较晚的时间点，检测到信号显著增强（图 3B），表明 siRNA 正义和反义链在完整哺乳动物细胞中分离。
图 4.siRNA 的体内分布。
图 A. 使用 NBD 标记的载体阳离子脂质体将用 Cy3 标记的 siRNA 转染至在盖玻片上生长的 HeLa S3 细胞中。在指定时间，使用荧光显微镜检查分析样本中 siRNA（红色）和脂质体（绿色）的相对分布。从载体脂质体释放后，siRNA 定位于紧邻核膜的区域。
图 B. 使用用 FAM 标记正义链并用 Cy3 标记反义链的靶向 c-myc 的 siRNA 转染在载玻片上生长的 HeLa S3 细胞。转染后 48 小时，处理细胞并使用徕卡共聚焦显微镜进行分析。箭头指向正义和反义 siRNA 单链（分别由红色和绿色焦点表示）。
图 5.由 siRNA 诱导的 RNAi 的诱导和持续时间。A. 使用靶向 GAPDH 3' UTR 的 siRNA 转染 24 孔培养皿中生长的 HeLa S3 细胞。转染后 4 小时、24 小时、3、6、10 和 12 天后，收获细胞，并通过 Northern 印迹分析对·GAPDH mRNA 和 28S rRNA 水平进行分析。B. 图 A 中的 Northern 数据图，显示相对 GAPDH mRNA 水平。C. 使用靶向 GAPDH 3' UTR 的 siRNA 转染 24 孔培养皿中盖玻片上生长的 HeLa S3 细胞。转染后 4 小时、24 小时、3、6、10 和 12 天后，收获细胞，并使用免疫荧光对·GAPDH 蛋白表达进行分析。DAPI（蓝色）染色细胞核；GAPDH（绿色）的抗体与表达蛋白结合。
图 6.正在分裂的 HeLa S3 细胞中 siRNA 的分布。使用 Cy3 标记的 siRNA（红色）转染盖玻片上生长的 HeLa S3 细胞，并使用免疫荧光进行分析。通过观察染色体凝聚和细胞核分离/再形成，在盖玻片上的细胞群中检测到包含 siRNA 的分裂细胞。使用 DAPI 分析 DNA。在细胞正在分裂或似乎刚经历过分裂事件的所有情况下，siRNA 均位于细胞的中心区域。
图 7. 与分裂细胞核相关的 siRNA。使用 FAM 标记的靶向 GAPDH 的 siRNA 转染盖玻片上生长的 HeLa-S3 细胞。转染后 48 小时，收获细胞并使用 4% 多聚甲醛固定。用 VectaShield（含 DAPI）将细胞固定在显微镜载玻片上，并使用适当的荧光滤光片进行检查。可以看到 siRNA（绿色）与分裂细胞的每个细胞核（蓝色）相关。
转染 siRNA 进入离散焦点的定位产生了以下问题：siRNA 是否集中于源自转染载体的脂质体囊泡。为解决这一问题，我们使用 NBD 标记的载体脂质体（绿色）重复转染，以转染用 Cy3 标记的 siRNA（红色）。我们检查了转染后 72 小时内多个时间点的红色和绿色荧光分布。转染后只需 4 小时即可检测到少量 siRNA 从脂质体容器中“释放”，而大多数脂质体和 siRNA 共定位于细胞中的焦点内，产生黄色荧光。转染后 24 小时和 48 小时观察到“游离”siRNA 量增加（图 4）。虽然在转染后 4 小时首次检测到蛋白沉默，但我们在转染后 24 小时观察到更显著的蛋白表达抑制，在转染后 48 小时观察到最大程度的蛋白减少（图 5）。mRNA 和蛋白水平的最长沉默期与从载体脂质体中释放最多 siRNA 的时间以及链分离量增加最多的时间相关（未显示数据）。
使用靶向 GAPDH 的 siRNA 转染 HeLa S3 细胞，以检测沉默诱导和沉默持续时间。GAPDH 会使 mRNA 和蛋白水平降低，持续时间长达 10 天，在此期间细胞应经历 10-12 次倍增。该数据表明 siRNA 被传递给子细胞。如果 siRNA 未被传递到子细胞中，则含 siRNA 的细胞百分比在仅仅 2 天或 3 天内就会大幅降低。支持性免疫荧光数据显示 siRNA 集中位于分裂细胞中（图 6），似乎进入子细胞（图 7）。
讨论
我们观察到荧光标记的 siRNA 可有效进入 RNAi 通路并诱导基因沉默，使我们能够追踪细胞内的 siRNA 并得出有关其作用模式和代谢的结论。
1.定位
使用已标记 siRNA，我们发现 dsRNA 在细胞核附近的细胞质中蓄积。转染后 4 小时，大多数转染 siRNA 保留在脂质体容器中。然而，至转染后 48 小时，siRNA 已与其脂质体载体解离，且似乎定位于紧邻核膜的细胞质中（图 4）。该定位可代表 siRNA 处理的位点或 RISC 所在的位点。先前对 RNAi 的研究表明，长 dsRNA 可降解成熟（例如细胞质）RNA（Montgomery 等人，1998）。尽管不清楚哺乳动物细胞中的 siRNA 是否通过相同的机制运行，但在这些实验中观察到的 siRNA 在细胞质中的蓄积与该情况一致。核周定位的另一个可能的解释是 siRNA 聚集在细胞核孔周围，在那里它可以“扫描”被转运到细胞质中的 mRNA。检测到互补序列时，则会靶向该信息进行切割，从而导致基因沉默。
2.链分离
尽管在细胞内检测到解离的单链 siRNA，但大多数转染 siRNA 似乎仍处于双链状态。链分离程度可能与直接切割靶基因所需的 siRNA 摩尔量成比例。
3.持续时间
此处提供的数据表明 siRNA 在细胞中可维持长达 10 天，并且 siRNA 被转移到子细胞中。如果这是真的，且哺乳动物细胞中未发生 siRNA 扩增，则 RNAi 效应的持续时间应与 siRNA 的细胞浓度和发生的细胞分裂次数成正比。这表明 siRNA 实验中的一个主要实验变量是 siRNA 递送的有效性和初始细胞 siRNA 浓度。
在有效 siRNA 转染效率较低的情况下，可使用已标记 siRNA 确定已成功转染 siRNA 的单个细胞。因此，缺乏已标记 siRNA 的细胞可用作内部阴性对照。已标记 siRNA 也可用于代谢研究，特别是在进行旨在确定具有临床意义的分子的实验时。
1.定位
使用已标记 siRNA，我们发现 dsRNA 在细胞核附近的细胞质中蓄积。转染后 4 小时，大多数转染 siRNA 保留在脂质体容器中。然而，至转染后 48 小时，siRNA 已与其脂质体载体解离，且似乎定位于紧邻核膜的细胞质中（图 4）。该定位可代表 siRNA 处理的位点或 RISC 所在的位点。先前对 RNAi 的研究表明，长 dsRNA 可降解成熟（例如细胞质）RNA（Montgomery 等人，1998）。尽管不清楚哺乳动物细胞中的 siRNA 是否通过相同的机制运行，但在这些实验中观察到的 siRNA 在细胞质中的蓄积与该情况一致。核周定位的另一个可能的解释是 siRNA 聚集在细胞核孔周围，在那里它可以“扫描”被转运到细胞质中的 mRNA。检测到互补序列时，则会靶向该信息进行切割，从而导致基因沉默。
2.链分离
尽管在细胞内检测到解离的单链 siRNA，但大多数转染 siRNA 似乎仍处于双链状态。链分离程度可能与直接切割靶基因所需的 siRNA 摩尔量成比例。
3.持续时间
此处提供的数据表明 siRNA 在细胞中可维持长达 10 天，并且 siRNA 被转移到子细胞中。如果这是真的，且哺乳动物细胞中未发生 siRNA 扩增，则 RNAi 效应的持续时间应与 siRNA 的细胞浓度和发生的细胞分裂次数成正比。这表明 siRNA 实验中的一个主要实验变量是 siRNA 递送的有效性和初始细胞 siRNA 浓度。
在有效 siRNA 转染效率较低的情况下，可使用已标记 siRNA 确定已成功转染 siRNA 的单个细胞。因此，缺乏已标记 siRNA 的细胞可用作内部阴性对照。已标记 siRNA 也可用于代谢研究，特别是在进行旨在确定具有临床意义的分子的实验时。
材料和方法
标记 siRNA
使用 Silencer Cy3 和 FAM siRNA 标记试剂盒 (Ambion) 标记化学合成的 siRNA (Ambion)。简言之，使用 7.5 µL 标记试剂标记 5 µg 靶向 c-myc 的化学合成 siRNA 及其加扰对照。标记后，按照生产商方案在转染前纯化、重悬和杂交单链。
转染
将 HeLa S3 细胞以 50,000 个细胞/孔的浓度铺板到含玻璃盖玻片 (11 mm) 的 24 孔组织培养板中。按照方案，铺板后 24 小时，使用 siPORT 脂质体转染试剂 (Ambion) 进行转染，组织培养基中 siRNA 的最终浓度为 100 nM。
免疫荧光
转染后 48 小时收获细胞、洗涤并在 4% 多聚甲醛中固定 5 分钟，然后对 c-myc 进行免疫荧光染色。用 PBS 洗涤细胞，在 0.1% Triton X-100 中渗透 5 分钟，再次洗涤，并在 3% BSA 中封闭 1 小时。加入一抗持续 1 小时，洗涤细胞，再加入二抗持续 1 小时。然后使用含 DAPI 的 VectaShield (Vector Labs) 洗涤和固定细胞。一抗 c-myc Ab-5（NeoMarkers, Freemont, CA；货号 MS-1054）按 1:200 的比例稀释使用；抗 GAPDH 的一抗（RDI；货号 TRK5G4-6C5）按 1:2000 的比例稀释使用。二抗 FITC 标记的驴抗小鼠 IgG (Jackson ImmunoResearch) 也按 1:200 的比例稀释使用。所有洗涤、稀释和孵育均在 1X PBS 中于室温下边搅拌边进行。使用带有适当荧光滤光片的 Olympus BX60 显微镜对细胞进行检查。使用 Hitachi KP-C571 相机进行显微照相。
RNA 分离和分析
使用 RNAqueous™-4PCR 试剂盒 (Ambion) 提取细胞培养物中的总 RNA，并通过分光光度计进行定量测定。使用 NorthernMax™-Gly 试剂盒 (Ambion) 测定各实验样本的靶基因和对照基因表达水平。
Cy3 是 Amersham BioSciences 的商标。
Silencer siRNA 标记试剂盒含有 MIRUS 为 Ambion 生产的试剂。
使用 Silencer Cy3 和 FAM siRNA 标记试剂盒 (Ambion) 标记化学合成的 siRNA (Ambion)。简言之，使用 7.5 µL 标记试剂标记 5 µg 靶向 c-myc 的化学合成 siRNA 及其加扰对照。标记后，按照生产商方案在转染前纯化、重悬和杂交单链。
转染
将 HeLa S3 细胞以 50,000 个细胞/孔的浓度铺板到含玻璃盖玻片 (11 mm) 的 24 孔组织培养板中。按照方案，铺板后 24 小时，使用 siPORT 脂质体转染试剂 (Ambion) 进行转染，组织培养基中 siRNA 的最终浓度为 100 nM。
免疫荧光
转染后 48 小时收获细胞、洗涤并在 4% 多聚甲醛中固定 5 分钟，然后对 c-myc 进行免疫荧光染色。用 PBS 洗涤细胞，在 0.1% Triton X-100 中渗透 5 分钟，再次洗涤，并在 3% BSA 中封闭 1 小时。加入一抗持续 1 小时，洗涤细胞，再加入二抗持续 1 小时。然后使用含 DAPI 的 VectaShield (Vector Labs) 洗涤和固定细胞。一抗 c-myc Ab-5（NeoMarkers, Freemont, CA；货号 MS-1054）按 1:200 的比例稀释使用；抗 GAPDH 的一抗（RDI；货号 TRK5G4-6C5）按 1:2000 的比例稀释使用。二抗 FITC 标记的驴抗小鼠 IgG (Jackson ImmunoResearch) 也按 1:200 的比例稀释使用。所有洗涤、稀释和孵育均在 1X PBS 中于室温下边搅拌边进行。使用带有适当荧光滤光片的 Olympus BX60 显微镜对细胞进行检查。使用 Hitachi KP-C571 相机进行显微照相。
RNA 分离和分析
使用 RNAqueous™-4PCR 试剂盒 (Ambion) 提取细胞培养物中的总 RNA，并通过分光光度计进行定量测定。使用 NorthernMax™-Gly 试剂盒 (Ambion) 测定各实验样本的靶基因和对照基因表达水平。
Cy3 是 Amersham BioSciences 的商标。
Silencer siRNA 标记试剂盒含有 MIRUS 为 Ambion 生产的试剂。
参考文献
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- Hammond SM, Boettcher S, Caudy AA, Kobayashi R, and Hannon GJ (2001) Argonaute2, a link between genetic and biochemical analyses of RNAi.Science 293: 1146-1150.
- Jarvis R and Ford LP, (2001) The siRNA target site is an important parameter for inducing RNAi in human cells.Ambion TechNotes 8(5): 3-5.
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